Detection of Listeria monocytogenes by PCR in artificially contaminated milk samples

Arq. Bras. Med. Vet. Zootec., v.62, n.4, p.973-979, 2010 Detecção de Listeria monocytogenes pela técnica de PCR em leite contaminado artificialmente [Detection of Listeria monocytogenes by PCR in artificially contaminated milk samples] N.D. Peres1, C.C. Lange2*, M.A.V.P. Brito2, J.R.F. Brito2, E.F. Arcuri2, M.M.O.P. Cerqueira3 1  Aluno de pós-graduação - EV-UFMG – Belo Horizonte, MG 2 Embrapa Gado de Leite Rua Eugênio do Nascimento, 610 36038-330 – Juiz de Fora, MG 3 Escola de Veterinária - UFMG – Belo Horizonte, MG RESUMO Avaliou-se a técnica de PCR como opção para reduzir o tempo de detecção de Listeria monocytogenes no leite. Para tanto, amostras de leite desnatado esterilizado e de leite cru integral – com baixa, média e alta contagem de microrganismos aeróbios mesófilos – foram inoculadas experimentalmente com diversas concentrações de L. monocytogenes. Os resultados da reação de PCR foram comparados com os da cultura da amostra empregando-se metodologia padronizada tradicional. Não se detectou L. monocytogenes pela reação de PCR quando esta foi realizada a partir do caldo de enriquecimento de Listeria (LEB) após 24 horas de incubação, nem no leite desnatado esterilizado, nem no leite cru integral. Após 48 horas de enriquecimento em LEB, a bactéria foi detectada por PCR nas amostras de leite desnatado esterilizado, com a sensibilidade de 1UFC/mL, mas não nas amostras de leite cru integral. Pela metodologia tradicional, a bactéria foi recuperada de todos os ensaios. Entretanto, nas amostras de leite cru com altas contagens de aeróbios mesófilos, a sensibilidade da metodologia tradicional foi reduzida (a partir de 7UFC/mL). Melhores resultados foram obtidos quando a reação de PCR foi feita utilizando-se DNA obtido diretamente da colônia suspeita em meio sólido (Oxford e Palcam). Foi possível substituir os testes fenotípicos de identificação de L. monocytogenes pela técnica de PCR reduzindo-se o tempo de identificação da bactéria de vários dias para algumas horas. Palavras-chave: patógeno alimentar, método de detecção, PCR, segurança do leite ABSTRACT The polymerase chain reaction (PCR) was used to detect Listeria monocytogenes in inoculated milk samples after selective enrichment. Samples of sterile skim milk and raw whole milk (with low, intermediate, and high counts of aerobic mesophilic microorganisms) were inoculated with several concentrations of L. monocytogenes. The results of PCR assays were compared to the results of culturing the samples using a standardized traditional method for isolation of L. monocytogenes. The pathogen was detected by PCR in Listeria Enrichment Broth (LEB) after 48h-incubation (sensitivity of 1CFU/mL) but not after 24h-incubation from the samples prepared with sterile skim milk. L. monocytogenes was not detected by PCR in LEB after 24 and 48h-incubation from the samples prepared with raw whole milk. Using the traditional method, the pathogen was detected in all experiments. However, sensitivity decreased in raw whole milk with high counts of aerobic mesophilic microorganisms (up to 7CFU/mL). Best results were obtained when PCR was done to identify presumptive L. monocytogenes colonies directly from Palcam and Oxford media, after the enrichment step. This procedure allowed reducing to a few hours the period of several days usually needed to obtain the final identification of L. monocytogenes using phenotypic tests. Keywords: food pathogen, detection method, PCR, food safety Recebido em 23 de março de 2009 Aceito em 12 de julho de 2010 *Autor para correspondência (corresponding author) E-mail: Peres et al. INTRODUÇÃO O gênero Listeria compreende seis espécies: L. monocytogenes, L. innocua, L. ivanovii, L. seeligeri, L. welshimeri e L. grayi (Liu, 2006). Por resistirem a grandes variações de pH, temperatura e concentrações salinas, as espécies de Listeria estão presentes em ampla variedade de ambientes, incluindo solo, água, efluentes e alimentos (Gandhi e Chikindas, 2007). Somente duas espécies do gênero são consideradas patogênicas, L. monocytogenes para o homem e outros animais e L. ivanovii para outros mamíferos (Liu, 2006). A doença causada no homem inclui infecções severas, como septicemias, encefalite, meningite e aborto, com altas taxas de hospitalizações e mortes. Acomete principalmente pessoas idosas, recém-nascidos, gestantes e indivíduos imunocomprometidos (Swaminathan, 2001). Devido à ampla disseminação, capacidade de sobreviver por longos períodos em condições adversas e de se multiplicar em temperaturas de refrigeração (2oC-4oC), L. monocytogenes tem muitas oportunidades de contaminar o ambiente de produção e processamento de alimentos. Consequentemente, tem sido uma grande preocupação para a indústria alimentícia, pois é responsável por uma significativa proporção das doenças transmitidas por alimentos em todo o mundo (Gandhi e Chikindas, 2007). Surtos e casos esporádicos de listerioses têm sido relacionados a diferentes tipos de alimentos, como leite, queijos, molhos e derivados cárneos (Swaminathan, 2001). Estudos realizados no Brasil têm comprovado a presença de L. monocytogenes no leite (Moura et al., 1993; Silva et al., 2003), queijo (Pimenta et al., 1999; Silva et al., 2003; Maricato et al., 2006; Zaffari et al., 2007) e produtos cárneos (Pimenta et al., 1999; Silva et al., 2004). Os métodos de diagnóstico tradicionais de isolamento de L. monocytogenes, aprovados por agências regulamentares, requerem vários dias para serem concluídos, pois exigem enriquecimento seletivo, plaqueamento em meios seletivos e confirmação bioquímica dos isolados (Gasanov et al., 2005). O uso de métodos moleculares pode abreviar o tempo de identificação dos métodos tradicionais. A reação de PCR tem sido empregada para detectar L. 974 monocytogenes em diferentes tipos de alimentos, incluindo leite e derivados (Starbuck et al., 1992; Fluit et al., 1993; Manzano et al., 1998; Aznar e Alarcón, 2003; Rijpens e Herman, 2004). Nesses estudos, foram relatados sucessos na identificação de L. monocytogenes pela amplificação de genes específicos. Em trabalho anterior, Lange et al. (2005) padronizaram a técnica de PCR para a identificação de L. monocytogenes testando três pares de oligonucleotídeos iniciadores, dois para a amplificação do gene da listeriolisina O e um para o gene iap (invasion-associated protein). Os melhores resultados foram obtidos com um par de oligonucleotídeos que amplificam o gene da listeriolisina O, o qual se mostrou sensível e específico para L. monocytogenes. O objetivo do presente trabalho foi avaliar a possibilidade de empregar a técnica de PCR para a detecção de L. monocytogenes diretamente do caldo de enriquecimento de amostras de leite contaminadas artificialmente com essa bactéria. MATERIAL E MÉTODOS Listeria monocytogenes ATCC 19117 foi usada em toda a fase experimental. A bactéria foi cultivada em caldo BHI (Brain Heart Infusion, Difco) e mantida a 4oC com passagens semanais. A inoculação experimental (...truncated)