AMDAR y PCR-extra-rápida para la identificación de la tottuga cabezona Caretta caretta (Testudines: Cheloniidae) utilizando el gen mitocondrial citocromo c oxidasa I (COI)

Univ. Sci. 2013, Vol. 18 (3): 321-330 doi: 10.11144/Javeriana.SC18-3.apit Freely available on line short communication AMDAR y PCR-extra-rápida para la identificación de la tortuga cabezona Caretta caretta (Testudines: Cheloniidae) utilizando el gen mitocondrial citocromo c oxidasa I (COI) Daniel Lancheros-Piliego, Javier Hernández Fernández AMDAR and PCR-Extra-fast for Molecular identification of the loggerhead sea turtle Caretta caretta (Testudines: Cheloniidae) using the mitochondrial gene cytochrome c oxidase I (COI) Abstract We molecularly identified the loggerhead turtle Caretta caretta using high-speed PCR amplification and restriction analysis of mitochondrial DNA. We isolated the DNA from blood from juvenile C. caretta from Don Diego beach (Magdalena; n=4), in Islas Del Rosario (Bolívar; n=2) in the Colombian Caribbean. By using high-speed PCR amplification of mitochondrial cytochrome c oxidase I (COI), we reduced reaction by one third and obtained fragments of 650 base pairs. We analyzed the amplified IOC product using enzymes HindIII, HpyCH4III and MseI and generated an electrophoretic profile, which compared in silico to other sea turtle species sequences, revealed the loggerhead’s specific pattern. We found similarity between 97-99% with C. caretta in five of the BLAST analyzed nucleotide sequences and 92% in another. We generated a bar code for the sampled turtle information and sequences and stored them in the BOLD database. The methodology described for the identification of C. caretta is a fast and inexpensive procedure that minimizes time and improves PCR specificity. Keywords: Caretta caretta; High-speed PCR; Cytochrome c oxidase I (COI); AMDAR; Barcode. Edited by Alberto Acosta Universidad Jorge Tadeo Lozano. Facultad de Ciencias Naturales e Ingeniería. Departamento de Ciencias Naturales y Ambientales. Grupo de investigación “GENBIMOL” Genética, Biología Molecular y Bioinformática, Carrera 4 No. 22-61, Bogotá, Colombia Received: 03-09-2013 Accepted: 07-11-2013 Published on line: 18-11-2013 Citation: Lancheros-Piliego D, Hernández Fernández J (2013) AMDAR y PCR-extra-rápida para identificación de la tortuga cabezona Caretta caretta (Testudines:Cheloniidae) utilizando el gen mitocondrial citocromo c oxidasa I (COI). Universitas Scientiarum 18(3): 321-330 doi: 10.11144/Javeriana.SC18-3.apit Funding: Dirección de Investigación, Creatividad e Innovación de la Universidad Jorge Tadeo Lozano. Electronic supplementary material: N/A SICI: 2027-1352(201309/12)18:3<321:ayppidltcccuegmcco>2.0.ts;2-d Introduction La tortuga cabezona Caretta caretta (Testudines: Cheloniidae) se distribuye en los océanos del mundo (en latitudes templadas, tropicales y subtropicales). Las principales playas de anidación se encuentran en la península de la Florida en Norteamérica (47.000–90.000 nidos/año en las dos últimas décadas; FWS 2013), en Brasil, Japón, en Grecia en el mar Mediterráneo, en Omán en el mar Arábigo y en la isla de Madagascar en África (Dodd 1988, European Environment Agency 2009). Esta especie también anida y se alimenta en algunas zonas del Caribe colombiano (Ministerio Universitas Scientiarum, Journal of the Faculty of Sciences, Pontificia Universidad Javeriana, is licensed under the Creative Commons 2.5 of Colombia: Attribution - Noncommercial - No Derivative Works. 322 del Medio Ambiente de Colombia 2002, CeballosFonseca 2004). Como parte de su ciclo de vida realiza migraciones importantes entre las zonas de alimentación y las playas de anidación valiéndose de las corrientes cálidas en el Océano Atlántico como la Corriente Norecuatorial y la Corriente del Golfo en el Caribe (Dodd 1988, Fitzsimmons et al. 1997, Monzón et al. 2012). La UICN (2013) cataloga a la tortuga cabezona en peligro A1 de extinción y al igual que las demás especies de tortugas marinas está protegida por leyes nacionales y acuerdos internacionales que pretenden mitigar la disminución de hembras anidantes por causas de origen antrópico (Barreto 2011, SWOT 2012, IUCN 2013). El declive de las poblaciones de esta tortuga en el Caribe colombiano es un fenómeno recurrente (Amorocho 2003, Invemar 2003, Barreto 2011). Ese declive poblacional está ocurriendo debido a factores como comercialización de la carne, los huevos, los caparazones y el aceite de las tortugas para el consumo humano (Rueda 2001, SWOT 2012), a esto se suma la captura incidental por pesquerías industriales y artesanales y la pérdida del hábitat (Eckert et al. 2000, Barreto 2011) y la polución marina (Barreto 2011, SWOT 2012). El proyecto Barcode of life (código de barras del DNA), es la mayor iniciativa genómica mundial para inventariar la biodiversidad del Planeta (Herbert et al. 2004). En los últimos años se ha convertido en uno de los programas internacionales más importantes para la identificación molecular de gran cantidad de especies (Herbert et al. 2004, Herbert et al. 2003, Hubert et al. 2008). Este proyecto sugiere que un fragmento de 648 pb de la región del gen mitocondrial citocromo c oxidasa subunidad I (COI o cox1), puede servir como etiqueta molecular, convirtiéndose en un código de barras para la identificación de especies animales (Herbert et al. 2003). Sin embargo, Naro_Maciel et al. (2010) reportaron un fragmento de 815 pb del COI para identificar las siete tortugas marinas que habitan los océanos Atlántico y Pacifico. El gen COI constituye el fundamento de los códigos de barras de DNA debido a que su tasa de mutación permite estudiar la biodiversidad de modo Universitas Scientiarum Vol. 18 (3): 321-330 Identificación molecular de la tortuga cabezona eficiente por que la secuencia de nucleótidos se conserva a nivel intraespecífico y es variable a nivel interespecífico (Hubert et al. 2008). Utilizando esta metodología, a Octubre del año 2013, la página WEB del proyecto tiene un reporte de 2.615.761 códigos de barras que describen 192.670 especies (Sujeevan & Hebert 2007). El código de barras para especies amenazadas facilita un sistema de identificación de organismos, que permite clasificar de manera rápida, simple y rentable diferentes muestras de especímenes saqueados, comercializados y capturados ilegalmente (Hajibabaei 2012, Naro-Maciel et al. 2010). Esta iniciativa mejora el conocimiento taxonómico, que es clave para el desarrollo de estrategias de conservación adecuadas (DeSalle & Amato 2004). La identificación molecular es de gran utilidad en biología de la conservación, en cuanto a censos de biodiversidad y cuando los métodos tradicionales son ineficaces, como en la identificación de huevos, formas larvarias, o en el análisis del contenido del estómago o los excrementos para determinar redes alimentarias (Stoeckle 2003). Además pueden ser potencialmente empleados en casos forenses para identificar muestras de tejidos obtenidos a partir del comercio ilegal o el uso de huevos y la carne (Hajibabaei et al. 2006). Los Códigos de barras de ADN también son aplicables en la investigación de campo p (...truncated)