Supplementation of fetal bovine serum alters histone modification H3R26me2 during preimplantation development of in vitro produced bovine embryos

Pesq. Vet. Bras. 35(7):605-612, julho 2015 DOI: 10.1590/S0100-736X2015000700002 Supplementation of fetal bovine serum alters histone modification H3R26me2 during preimplantation development of in vitro produced bovine embryos1 Daniel R. Arnold2, Carolina A.P. Corrêa3, Laura L.G. Lorena4, Roberta C. Gaspar3, Guilherme F. Rossi3, Aderson M. Ifran3, João C.T. Penteado4, Gisele Mingoti4 and Flavia L. Lopes4* ABSTRACT.- Arnold D.R., Corrêa C.A.P., Lorena L.L.G., Gaspar R.C., Rossi G.F., Ifran A.M., Penteado J.C.T., Mingoti G. & Lopes F.L. 2015. Supplementation of fetal bovine serum alters histone modification H3R26me2 during preimplantation development of in vitro produced bovine embryos. Pesquisa Veterinária Brasileira 35(7):605-612. Departamento de Apoio, Produção e Saúde Animal, Faculdade de Medicina Veterinária de Araçatuba, Universidade Estadual Paulista, Rua Clovis Pestana 793, Araçatuba, SP 16050-680, Brazil. E-mail: In vitro production (IVP) of bovine embryos is not only of great economic importance to the cattle industry, but is also an important model for studying embryo development. The aim of this study was to evaluate the histone modification, H3R26me2 during pre-implantation development of IVP bovine embryos cultured with or without serum supplementation and how these in vitro treatments compared to in vivo embryos at the morula stage. After in vitro maturation and fertilization, bovine embryos were cultured with either 0 or 2.5% fetal bovine serum (FBS). Development was evaluated and embryos were collected and fixed at different stages during development (2-, 4-, 8-, 16-cell, morula and blastocyst). Fixed embryos were then used for immunofluorescence utilizing an antibody for H3R26me2. Images of stained embryos were analyzed as a percentage of total DNA. Embryos cultured with 2.5% FBS developed to blastocysts at a greater rate than 0%FBS groups (34.85+5.43% vs. 23.38+2.93%; P<0.05). Levels of H3R26me2 changed for both groups over development. In the 0%FBS group, the greatest amount of H3R26me2 staining was at the 4-cell (P<0.05), 16-cell (P<0.05) and morula (P<0.05) stages. In the 2.5%FBS group, only 4-cell stage embryos were significantly higher than all other stages (P<0.01). Morula stage in vivo embryos had similar levels as the 0%FBS group, and both were significantly higher than the 2.5%FBS group. These results suggest that the histone modification H3R26me2 is regulated during development of pre-implantation bovine embryos, and that culture conditions greatly alter this regulation. INDEX TERMS: Bovine, embryo development, H3R26me2, in vitro produced, fetal bovine serum. RESUMO.- [Suplementação com soro fetal bovino altera a modificação de histona H3R26me2 durante o período pré-implantacional em embriões bovinos produzidos in vitro.] A produção in vitro (PIV) de embriões de bovinos não é apenas de grande importância econômica para a pecuária, mas é também um importante modelo para estudar Received on September 11, 2014. Accepted for publication on July 23, 2015. 2 In Vitro Brasil S/A, Rodovia SP-340 Km 166, Cx. Postal 238, Mogi Mirim, SP 13800-970, Brazil. E-mails: , carolinaalves@ usp.br 3 Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, Universidade Estadual Paulista (Unesp), Via de Acesso Prof. Paulo Donato Castellane s/n, Jabo- ticabal, SP 14884-900, Brazil. E-mails: roberta_cordeirogaspar@hotmail. com, , 4 Departamento de Apoio, Produção e Saúde Animal, Faculdade de Medicina Veterinária de Araçatuba, Unesp, Rua Clovis Pestana 793, Araçatuba, SP 16050-680, Brazil. E-mails: , , ; *Corresponding author: flavialopes@ fmva.unesp.br 1 605 606 Daniel R. Arnold et al. o desenvolvimento embrionário. O objetivo deste estudo foi avaliar a modificação de histona, H3R26me2 durante o desenvolvimento pré-implantacional em embriões bovinos produzidos in vitro, cultivados com ou sem suplementação de soro fetal bovino (SFB), bem como comparar essa modificação específica entre mórulas produzidas in vitro e in vivo. Após a maturação in vitro e fertilização, embriões foram cultivados com suplementação de 0 ou 2,5% SFB. O desenvolvimento embrionário foi avaliado e embriões foram coletados e fixados em diferentes fases durante o desenvolvimento (2, 4, 8 e 16 células, mórula e blastocisto). Os embriões fixados foram avaliados por imunofluorescência utilizando um anticorpo para H3R26me2. Imagens de embriões corados foram analisadas baseadas na porcentagem do DNA total. Embriões cultivados com 2,5% SFB tiveram uma taxa de desenvolvimento ao estágio de blastocisto maior que o grupo que não recebeu suplementação com SFB (34.85±5,43% vs 23.38±,93%; P<0,05). Níveis de H3R26me2 variaram para ambos os grupos ao longo do desenvolvimento. No grupo 0% SFB, a marcação para H3R26me2 foi mais intensa nos estágios de 4 células (P<0,05), 16 células (P<0,05) e mórula (P<0.05). No grupo 2.5% SFB, apenas os embriões de 4 células tiveram marcação significativamente maior que todas as outras fases (P<0,01). Mórulas produzidas in vivo apresentaram níveis de H3R26me2 semelhantes ao grupo 0% SFB, e ambos foram significativamente maiores que o grupo 2.5% SFB. Estes resultados sugerem que a modificação de histona H3R26me2 é regulada durante o desenvolvimento pré-implantacional de embriões bovinos, e que as condições de cultura alteram de maneira importante esta regulação. TERMOS DE INDEXAÇÃO: Bovino, desenvolvimento embrionário, H3R26me2, produção in vitro, soro fetal bovino. INTRODUCTION In vitro production (IVP) of embryos has revolutionized the way infertility is addressed. Since the birth of Louise Brown in 1978 (Steptoe & Edwards 1978), fertility clinics worldwide have adopted this procedure. Besides humans, another industry where IVP has become widely accepted is the cattle industry. In 2011, 453,471 bovine IVP embryos were produced, with 343,927 being used for embryo transfer (Stroud 2012). While production of in vitro embryos is common, the rate of development is still very low when compared to embryos produced in vivo (Hansen et al. 2010). These low results are primarily due to the inability to replicate the in vivo environment in a laboratory setting. Conditions for which embryos are exposed prior to implantation are vital for proper embryonic development and successful establishment of pregnancy (Hansen et al. 2010; Besenfelder et al. 2012). This is most evident in IVP embryos, where changes to culture conditions can dramatically affect embryo developmental rates, and remains a major field of research. The source of protein in media is an area of great interest. Fetal bovine serum (FBS) is the most common protein source in media. Culture media containing FBS generally produce better blastocyst rates, due to the growth factors Pesq. Vet. Bras. 35(7):605-612, julho 2015 and other known and unknown components that the growing embryo requires (Van Langendonckt et al. 1997), even though early embryo development may be delayed (Gardner 1998, Thompson 2000). In addition, the use (...truncated)