Construcción de mutantes de Salmonella enterica por inactivación de los genes invG/invE y ssaJ/ssaK de las islas de patogenicidad 1 y 2

ARTÍCULO DE INVESTIGACIÓN Construcción de mutantes de Salmonella entérica por inactivación de los genes invG/invE y ssaJ/ssaK de las islas de patogenicidad 1 y 2 Constructing Salmonella enterica mutants for inactivating invG/invE y ssaJ/ssaK genes from pathogenicity islands 1 and 2 Judith Velasco1*, María Araque2, Juan A. Ayala3- Resumen Para la comprensión de las bases genéticas de los mecanismos de patogenicidad de Salmonella se han descrito diversas metodologías para manipular el ADN genómico y generar mutantes con características particulares. En este estudio se reporta la construcción de mutantes a partir de varios serotipos de S. enterica, por sustitución e inactivación de los genes invG/invE en SPI-1 y de los genes ssaJ/ssaK en SPI-2 mediante la técnica de recombinasa Red del fago λ descrita por Datsenko y Wanner (2000). Los genes delecionados en las SPI-1 y SPI-2 codifican para las proteínas que participan en la formación de los sistemas de secreción tipo III, responsables de la invasión y supervivencia intracelular de S. enterica en las células hospedadoras. Los resultados de este trabajo permitirán realizar estudios futuros in vivo para evaluar la posible atenuación de la virulencia de las cepas mutantes, así como aportar nuevos conocimientos sobre los mecanismos genéticos involucrados en la fisiopatogenia de las enfermedades producidas por los serovares estudiados. Además, esta técnica se recomienda para generar de manera eficiente mutantes de diferentes serotipos de Salmonella entérica con la finalidad de estudiar los genes cromosómicos y sus productos. Palabras clave: recombinasa red λ, mutación, islas de patogenicidad, Salmonella enterica. Abstract Several methods have been described for manipulating and producing mutant genomic DNA having specific characteristics in an attempt to understand the genetic basis for Salmonella pathogenicity. This study reports the construction of mutants from several S. enterica serotypes, the substitution and inactivation of invG/ 1 2 3 Licenciada en Bioanálisis, Especialista en Microbiología, Departamento de Microbiología y Parasitología, Facultad de Farmacia y Bioanálisis, Universidad de los Andes, Mérida, Venezuela. Médico cirujano, Doctora en Ciencias Médicas Fundamentales, Departamento de Microbiología y Parasitología, Facultad de Farmacia y Bioanálisis, Universidad de los Andes, Mérida, Venezuela. Licenciado en Ciencias Químicas (Bioquímica), Doctor en Ciencias Químicas (Bioquímica), Centro de Biología Molecular “Severo Ochoa” CSIC-UAM, Campus de Cantoblanco, Madrid, España. Mutantes Rev. Colomb. de S.Biotecnol. enterica porVol. inactivación XII No. 2deDiciembre los genes 2010 invG/invE 55-66y ssaJ/ssaK 55 invE genes in the SPI-1 gene and ssaJ/ssaK in the SPI-2 gene by the phage λ Red recombinase technique, as described by Datsenko and Wanner (2000). Gene deletion in SPI-1 and SPI-2 encodes proteins involved in the formation of type III secretion systems responsible for S. enterica invasion and intracellular survival in host cells. The results of this work will lead to in vivo studies evaluating the possible attenuation of mutant strain virulence and provide new insights into the genetic mechanisms involved in the pathogenesis of diseases caused by these bacteria. Moreover, this technique is recommended for efficiently generating mutants from different S. enterica serotypes for studying chromosomal genes and their products. Key words: λ red recombinase, mutation, pathogenicity islands, Salmonella enterica. Recibido: mayo 25 de 2010 Aprobado: octubre 7 de 2010 Introducción Diversos factores de virulencia de Salmonella están codificados por genes que se encuentran agrupados en las islas de patogenicidad SPI (del inglés: Salmonella Pathogenicity Islands). En la actualidad se han descrito 17 SPI diferentes, de las cuales se han caracterizado 14. Sin embargo, las SPI1 y SPI2 son las que codifican los determinantes que median la invasión y la supervivencia intracelular (Darwin y Miller, 1999; Hensel, 2004; Vernikos y Parkhill, 2006; Morgan, 2007). Para la comprensión de las bases genéticas de los mecanismos de patogenicidad de Salmonella se han descrito diversas metodologías para manipular el ADN genómico y generar mutantes con características particulares. Estos métodos comprenden varios procesos de recombinación, uso de enzimas de restricción y vectores suicidas (Collazo et al., 1995; Boyd et al., 1997; Beuzón et al., 2000). No obstante, el sistema de recombinasa Red del Bacteriófago λ, propuesto por Datsenko y Wanner (2000), es un método simple y altamente eficiente para inducir mutaciones o inactivar genes en el genoma de E. coli y en otras bacterias Gram-negativas, a través de recombinaciones homólogas utilizando productos de PCR. Este sistema tiene la ventaja de utilizar pequeñas regiones homólogas (< 50 pb), lo que permite generar mutaciones en cualquier zona del genoma bacteriano (figura 1). Además, comparado con las técnicas clásicas de ingenie56 ría genética no utiliza enzimas de restricción ni ADN ligasas (Santoyo, 2008). En este trabajo se reporta la construcción de mutantes a partir de varios serotipos de S. enterica, por sustitución e inactivación de los genes invG/invE en SPI-1 y de los genes ssaJ/ssaK en SPI-2 mediante la técnica de recombinasa Red del fago λ (figura 2). Los genes delecionados en las SPI-1 y SPI-2 codifican proteínas que participan en la formación de los sistemas de secreción tipo III (SSTIII), responsables de la invasión y sobrevivencia intracelular de S. enterica en las células hospedadoras. Los resultados de este trabajo permitirán estudios futuros in vivo para evaluar la posible atenuación de la virulencia de las cepas mutantes, así como aportar nuevos conocimientos sobre los mecanismos genéticos involucrados en la fisiopatogenia de las enfermedades producidas por estas bacterias. Materiales y métodos Cepas bacterianas, plásmidos y condiciones de cultivo Las cepas bacterianas y plásmidos utilizados en este estudio se muestran en la tabla 1. Todas las cepas fueron cultivadas en caldo y agar Luria Bertani (LB). En algunos casos los medios de cultivo fueron suplementados con 30 μg/ml de kanamicina (Km) o 100 μg/ml de ampicilina (Amp) según corresponda al mutante ensayado. Los cultivos fueron incubados Rev. Colomb. Biotecnol. Vol. XII No. 2 Diciembre 2010 55-66 Figura 1. Metodología para la construcción de mutantes A. Esquema de la técnica de inactivación genética empleada. Pasos 1 y 2: amplificación por PCR usando iniciadores de 56 nt de largo, que amplifican el gen de resistencia a kanamicina (Km R) que se encuentra flanqueado por regiones FRT (Flipase Recognition Target), el vector molde se muestra en B, y regiones homólogas a los genes adyacentes al gen de interés. Paso 3: transformando con estos fragmentos de resistencia al antibiótico previamente digerido con DpnI y purificado estirpes bacterianas conteniendo el vector pKD46, de bajo número de copias y termosensibl (...truncated)