Aflatoksin B1'in Zebra balıgının (Danio rerio (Hamilton)) Embriyo ve Larvaları Üzerine Olan Toksik Etkileri

Süleyman Demirel Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü Dergisi, 11-1 (2007),13-17 Aflatoksin B 1 ’in Zebra balığının (Danio rerio (Hamilton)) Embriyo ve Larvaları Üzerine Olan Toksik Etkileri TURGAY ŞİŞMAN1, YILMAZ YILDIRIM2 1 Atatürk Üniversitesi, Fen Edebiyat Fakültesi, Biyoloji Bölümü / ERZURUM Kağıthane Atatürk İlköğretim Okulu, Seyrantepe Mah., A.Yokuşu Cad.,Can Sok., No:2- Kağıthane / İSTANBUL Alınış Tarihi: 14.09.2006, Kabul: 23.05.2007 2 Özet: Bu çalışmada, toksik bir küf metaboliti olan Aflatoksin B 1 (AFB 1 )’in Danio rerio embriyolarının gelişimi üzerine olan teratojenik etkileri araştırılmıştır. Artan konsantrasyonlarda AFB 1 uygulanan balık embriyolarında çeşitli anormallikler 96 saat süreyle gözlenmiştir (24hpf, 48 hpf, 72 hpf, 96 hpf). Bu anormallikler Raşisis (gelişimde gerileme), Lordoz (vertebra anormalliği), kardiak ödemi, çeşitli vücut kısımlarının oluşmamasıdır. AFB 1 ’e maruz kalma süresi ve konsantrasyon arttıkça anormalliklerin görülme sıklığı ve ölümler de artmıştır. Hemen hemen bütün dozlarda anormallikler gözlenmiş ancak kontrol gruplarında hiçbir anormallik gözlenmemiştir. Kontrol ve deney grupları arasındaki fark istatistiksel olarak önemli bulunmuştur (P<0.05). AFB 1 ’in neden olduğu malformasyonların olası mekanizması tartışılmıştır. Anahtar Kelimeler: Danio Rerio, AFB 1 , Teratojenik Etki, Embriyo, Larva. The Toxic Effects of Aflatoxin B 1 on the Embryos and Larvae of Zebrafish (Danio rerio (Hamilton)) Abstract: In the current study, the teratogenic effects of Aflatoxin B 1 , a toxic mold metabolite, on the development of embryos and larvae of Danio rerio were investigated. The various abnormalities were observed in fish embryos and larvae exposed to increasing concentrations of AFB 1 during 96 hours (24 hpf, 48 hf, 72 hpf and 96 hpf). This abnormalities are Rachisis (regression of development), Lordosis (tail defect), cardiac edema, not formed of various body structures. Mortality and frequency of occuring abnormalities increased when it was increased the time of exposed to AFB 1 and concentration. Abnormalities were observed in almost all doses. Abnormalities were not observed in control groups. It was found that the difference between control and test groups is statistically significant (P<0.05). The possible mechanism of the malformations caused by AFB 1 was discussed. Keywords: Danio Rerio, AFB 1 , Teratogenic Effect, Embryo, Larva. ________________________________ Giriş Mikotoksinler, birçok toksijenik küf türü tarafından sentezlenen, insan ve hayvanlar tarafından alındıklarında, akut ya da kronik intoksikasyonlara neden olan sekonder metabolitlerdir. Yaklaşık 300 küf türünün mikotoksin oluşturduğu, bunların içinden 100 tanesinin insan ve hayvanlar için toksik olduğu bilinmektedir. Yapılan deneysel çalışmalara göre toksik etkisi en yüksek olan mikotoksinlerden birisi olarak aflatoksinler gösterilmektedir. Aflatoksinler, Aspergillus flavus ve Aspergillus parasiticus adı verilen funguslar tarafından üretilen son derece toksik, mutajenik, karsinojenik, hepatotoksik ve teratojenik sekonder metabolitlerdir. Bu funguslar bir çok ürünü kontamine etmekte ve kontamine ürünler de insan ve birçok çiftlik hayvanının sağlığını ciddi şekilde tehdit etmektedir. Aflatoksikozis olaylarının yaklaşık %7583’üne neden olan Aflatoksin B 1 (AFB 1 ), doğada yem maddelerinin üzerinde üreyen küflerin en yaygın metabolitidir. Aflatoksinin 18 ayrı türü bulunmasına rağmen yem ve yem maddelerinde en fazla tespit edilenler AFB 1 , AFB 2 , AFG 1 ve AFG 2 ’dir (Hartley vd., 1963). Aflatoksinli besinleri alan insan ve hayvanlarda akut, subakut ve kronik aflatoksikozis görülür. Akut zehirlenmeler oldukça fazla miktarda (6.3-15.6 ppm) aflatoksin alımı ile gerçekleşir ve solunum güçlüğü, burun akıntısı, besinlerden yararlanma isteğinin kaybolması (anoreksi), vücut dengesi ile hareket uyumu arasındaki anormallik (ataksi), iştahsızlık, kanlı ishal ve sonuçta ölüm meydana gelir. Düşük dozlarda ve uzun süre aflatoksin alınımına bağlı olarak ortaya çıkan kronik zehirlenmeler akut zehirlenmeye oranla daha sık ve yaygın olarak görülmektedir. Bu tip zehirlenmelerde klinik belirtiler genelde net olmadığından, tanımlanmaları oldukça güçtür ve önemli ekonomik kayıplara neden olmaktadır. Aflatoksinlerden uzun süre etkilenmiş hayvanlarda yem tüketimi, yemden yararlanma etkinliği, büyüme hızı veya canlı ağırlık artış oranı oldukça düşer. Kıl örtüsü zayıflar, anemi, karın büyümesi, hafif derecede sarılık, depresyon, iştahsızlık, immun sistemin yetersizliği, stres koşullarına uyum yeteneğinin azalması, hastalıklara karşı dirençsizlik ve ölüm oranlarının artması gibi belirtiler ortaya çıkar. Farklı canlı gruplarında, toksik etki meydana getiren aflatoksinlerin, LD 50 değerleri yaşa, cinsiyete, türe, beslenme tarzına, vücut ağırlığına ve sıcaklığa bağlı olarak değişmektedir (Patterson, 1973; Davis ve Diener, 1978). Aflatoksinlerin omurgasız hayvanlar üzerindeki insektisit ve larvisit etkileri, çeşitli araştırmacılar tarafından gösterilmiştir. AFB 1 ile kontamine edilmiş besiyerinde 13 T. ŞİŞMAN, Y.YILDIRIM yetiştirilen D. melanogaster türünde larval ve pupal mortalite artmış ve çeşitli teratojenik etkiler gözlenmiştir (Chinnici vd., 1976; Lalor vd., 1976). Benzer bir araştırmada ise AFB 1 ’in ergin sineklerin kanat, bacak ve abdomeninde çeşitli fenotipik anormallikler meydana getirdiği (Uysal ve Şişman, 2003) ve Drosophila melanogaster türünde hem otozomal, hem de eşeye bağlı karakterleri etkilediği belirtilmektedir (Chinnici ve Melone, 1985; Şişman vd., 2005). Ancak yapılan literatür çalışmalarında AFB 1 ’in Zebra balığının embriyoları üzerindeki etkileri ile ilgili herhangi bir araştırmaya rastlanılamamıştır. Bu araştırmada, Aflatoksin B 1 ’in Zebra balığının embriyoları üzerindeki teratojenik etkilerinin belirlenmesi amaçlanmıştır. Bu testlerden en yaygın kullanılanı ve en güvenilir olanı ELS (Early Life Stage) Testi’dir (Nagel, 2002; Roex vd., 2002; Hallare vd., 2004; Hutchinson vd., 2003). Bu araştırmada, AFB 1 ’in toksisitesini belirlemek amacıyla, bu test kullanılmıştır. Bu teste göre, toksisitesinden şüphelenilen kimyasal madde, yeni döllenmiş balık yumurtalarına farklı dozlarda 96 saat süreyle uygulanır. 48 saatte embriyoların yarısını öldüren doz, olarak belirlenir. LD 50 değerinin bir alt dozu (subletal) uygulama dozu olarak belirlenir ve 96 saatlik uygulama sonucunda çeşitli anormallikler gözlenirse uygulanan maddenin toksik olduğuna hükmedilir. Embriyo ve Larvalara AFB 1 ’nin Uygulanması Bunun için AFB 1 ’den 10 ppm’lik stok solüsyon hazırlanmıştır (1 mg AFB 1 %10’luk 100 ml DMSO içinde çözündürülür) ve bu solüsyondan 5 farklı konsantrasyonda (0.2, 0.5, 0.8, 1.4, 1.7 ve 2.0 ppm) uygulama yapılmıştır. Kontrol grubu olarak 50 ml Holtfreter Sölüsyonu ve 50 ml %10’luk DMSO kullanılmıştır. Döllenmiş yumurtalar (her petri için 30 adet) içinde 50 ml Holtfreter Solüsyonu+ AFB 1 bulunan petri kaplarına alınmış, 14:10 fotoperiyot uygulanan bir ortamda 26 oC’ye ayarlı in (...truncated)