Axenic culture of the sea cyanobacterias Aphanothece halophytica Frémy, 1933 and Chroococcus minutus (Kützing) Nägeli, 1849

ARTIGOS ARTICLES   Cultivo axênico das cianobactérias marinhas Aphanothece halophytica Frémy, 1933 e Chroococcus minutus (Kützing) Nägeli, 1849   Axenic culture of the sea cyanobacterias Aphanothece halophytica Frémy, 1933 and Chroococcus minutus (Kützing) Nägeli, 1849     Rodrigo de Siqueira Melo1; Maria Helena Campo Baeta Neves; Odara Ramôa Baptista Instituto de Estudos do Mar Alte Paulo Moreira, Departamento de Oceanografia, Arraial do Cabo, RJ, Brasil     RESUMO O presente estudo demonstra o método utilizado para a obtenção do cultivo axênico das cianobactérias Aphanothece halophytica e Chroococcus minutus, obtidas das salinas do município de Arraial do Cabo - RJ. Nas salinas, esses organismos estão estruturados em mats microbianos, o que torna o seu isolamento mais difícil e, consequentemente, a obtenção de culturas axênicas. Desta forma, utilizando a combinação de técnicas de microscopia associado à utilização de azida sódica e fluoreto de sódio para inibição da cadeia transportadora de elétrons e da glicólise respectivamente, apenas os microorganismos que realizassem fotossíntese conseguiriam sobreviver. Durante o crescimento das cianobactérias, foram realizadas medições biométricas das características morfológicas para monitorar o desenvolvimento desses microorganismos em meio limitante. Ao final do período proposto de crescimento, observamos que a metodologia aplicada para o isolamento e obtenção das culturas axênicas foi eficaz como uma alternativa para cultivar as cianobactérias A. Halophytica e C. minutus. Palavras-chave: azida sódica, fluoreto de sódio, morfoespécies, BG-11 e cultura unialgal ABSTRACT This work demonstrates the method used to obtain axenic culture of the cyanobacteria Aphanothece halophytica and Chroococcus minutes, both from salt flats in Arraial do Cabo municipality, Rio de Janeiro state. In salt flats, these organisms are structured microbial mats, which makes their isolation more difficult and consequently the establishment of axenic cultures. Thus, using a combination of microscopy techniques associated with the use of sodium azide and sodium fluoride for inhibition of the electron transport chain and glycolysis, respectively, only microorganisms that carry out photosynthesis could survive. During cyanobacteria growth, biometric measurements were performed to monitor the morphological development of these microorganisms in limiting medium. At the end of the proposed growth period, we observed that the methodology applied for isolation and obtaining axenic cultures was effective as an alternative to grow the cyanobacteria A. halophytica and C. minutus. Key words: sodic azide, sodium fluoreto, morphospecies, BG-11 and unialgal culture     Introdução As cianobactérias são organismos fotossintetizantes procarióticos e filogeneticamente do grupo das bactérias gram-negativas, com distribuição cosmopolita, variando de ambientes extremos como fontes termais à regiões Árticas e Antarticas (Sinha & Häder 2008). Os "algal mats" são esteiras microbianas presentes em ambientes com extrema salinidade, onde a incidência luminosa determina as posições verticais estratificadas dos grupos funcionais de microorganismos neste ambiente (Ladakis et al. 2006). Segundo Badger et al. (2006), nos ambientes hipersalinos, as cianobactérias possuem um função chave na produção de uma mucilagem, auxiliando a estruturação dos algal mats. A mobilidade das cianobactérias, em associação com uma notável excreção de polissacarídeos extracelulares, possibilita os organismos a se distribuírem em diferentes tipos de sedimentos (Rios et al. 2004). As cianobactérias são organismos halotolerantes por possuírem mecanismos específicos que ajustam intracelularmente o status osmótico (Apse & Blumwald 2002). A. halophytica e C. minutus podem desenvolver-se em condições de extrema alcalinidade através da regulação de canais de Na+ / H+ e tolerância de 0.25 à 3.0 M de cloreto de sódio (NaCl) devido à produção de moléculas osmoprotetoras como glicina betaina, trealose e glicerol (Laloknam et al. 2006). Nos mats, essas espécies de cianobactérias possuem a capacidade de sobreviver em condições de baixa concentração nutricional, intensa variação luminosa, longos períodos de dessecação, alta produção de exopolissacrídeos, limitação da difusão de O2 e CO2 e variabilidade de temperatura e salinidade (Badger et al. 2006). Como consequência, as cianobactérias formam agregados onde bactérias e outros organismos estão firmemente aderidos, respresentando uma grande dificuldade para obtenção de culturas unialgais e axênicas (Vázquez-Martínez et al. 2004). Desta forma, diversos métodos para obtenção de culturas axênicas de cianobactérias têm sido sugeridos (Choi et al. 2002). Em alguns métodos descritos na literatura, como por exemplo o uso de antibióticos seletivos, provou ser ineficaz na presença de mucilagem produzida pela cianobactérias, por abrigarem e protegerem as bactérias dos antibióticos (Cho et al. 2002). Desta forma, o presente trabalho teve como objetivo coletar, isolar e obter cultivo axênico das espécies de cianobactérias A. halophytica e C. minutus, obtidas a partir dos algal mats das salinas de Arraial do Cabo (RJ).   Material e métodos Coleta dos algal mats As cianobactérias unicelulares e halotolerantes Chroococcus minutus (Kützing) Nägeli 1849 e Aphanothece halophytica Frémy 1933 foram isoladas a partir de amostras de "microbial mats", coletados em uma profundidade de 0 - 5 cm nos cristalizadores das salinas do município de Arraial do Cabo (22º56'57 S e 42º04'19 W, Estado do Rio de Janeiro - RJ - Brasil). A amostra foi transportada para o Laboratório de Biofilme do Instituto de Estudos do Mar Almirante Paulo Moreira - IEAPM (Marinha do Brasil) e mantida sob refrigeração a 15 °C. Posteriormente, a amostra foi avaliada por meio de lupa e de microscópio óptico com o propósito de determinar a camada no "algal mats" onde se localizavam as cianobactérias de interesse com vista à sua remoção para a realização do isolamento, sendo utilizado o sistema de classificação taxonômica de Komárek & Anagnotidis (1999). Elaboração do meio de cultura O meio de cultura líquido foi preparado dissolvendo todos os componentes mencionados na Tabela 01 em água do mar pré-tratada através de filtração e, posteriormente, esterilizada em autoclave a 120 ºC durante 20 min, possuindo pH final de 7.1 e salinidade de 50 (5,0 %) após seu resfriamento.     O meio de cultura sólido foi constituído dissolvendo agar a 1,5% no meio BG-11 modificado pela adição de bicarbonato (HCO3-) na concentração final de 3 mM. O agar foi preparado com o dobro da concentração desejada (3%) e cortado em pequenos blocos, que foram lavados em água destilada durante 96 horas com o objetivo de eliminar impurezas que poderiam inibir o crescimento em gelose. Os blocos de agar foram, então, aquecidos e misturados na proporção de 1:1 com o meio BG-11 modificado c (...truncated)