Potencial anti-apoptótico de p38 en cáncer de próstata

TRABAJO EXPERIMENTAL ACTAS UROLÓGICAS ESPAÑOLAS SEPTIEMBRE 2005 Potencial anti-apoptótico de p38 en cáncer de próstata M. Ricote Belinchón1, F.R. Bethencourt Codes2, I. García-Tuñón Llanio1, B. Fraile Láiz1, C. Fernández Sáez3, P. Aller Tresguerres3, J. González-García2, R. Vera San Martín1, R. Paniagua Gómez-Álvarez1, M. Royuela García1 1Departamento de Biología Celular y Genética, Universidad de Alcalá. 2Departamento de Urología del Hospital Príncipe de Asturias. Alcalá de Henares. 3Centro de Investigaciones Biológicas, Consejo Superior de Investigaciones Científicas. Madrid. Actas Urol Esp 2005; 29 (8): 769-776 RESUMEN POTENCIAL ANTI-APOPTÓTICO DE P38 EN CÁNCER DE PRÓSTATA Introducción: En cáncer de próstata, la vía de señalización intracelular de TNF-α parece estar desviada hacia la activación de p38. p38 podría proteger a las células tumorales de la muerte inducida por TNF-α. Nos propusimos estudiar el papel que desempeña p38 tanto in vivo (evaluando algunos factores activados por p38 en cáncer de próstata), como in vitro (en las líneas celulares tumorales de próstata LNCaP y PC3, tratadas previamente con TNF-α). Material y métodos: Para los estudios in vitro se utilizaron las líneas celulares LNCaP y PC3. Los tratamientos se realizaron con TNF-α (diferentes concentraciones) y el inhibidor específico de p38 (SB203580). El índice apoptótico se evaluó mediante DAPI y citometría de flujo. La activación de p38 se determinó mediante Western blot. Para los estudios in vivo se usaron 15 próstatas normales (PN) y 27 de cáncer (CP) procesadas para inmunohistoquímica y Western blot. Resultados: In vitro, el aumento de la concentración de TNF-α indujo apoptosis en LNCaP, pero no en PC3. El tratamiento con TNF-α produjo un aumento de la fosforilación de p38 en concentraciones intermedias, mientras que en PC3 no se observaron cambios en la activación. El pretratamiento con SB203580 y TNF-α produjo un aumento significativo de la apoptosis en LNCaP. In vivo todos los pacientes con PN resultaron positivos para p-Elk-1 y p-ATF-2 (núcleo de células epiteliales). En CP no sólo aumenta la expresión de estos factores, sino que se localizaron tanto en núcleo como en citoplasma. Conclusión: Nuestros datos in vitro e in vivo sugieren que p38 juega un importante papel en la progresión del cáncer de próstata. Estas observaciones sugieren que tratamientos centrados en el control de la activación de p38 podrían ser efectivos en el tratamiento contra el cáncer de próstata. Palabras clave: Cáncer de próstata. TNF-α. p38. LNCaP. PC3. ABSTRACT ANTI-APOPTOTIC POTENCIAL ROLE OF P38 IN PROSTATE CANCER Introduction: TNF-α transduction pathway in prostate cancer seems to be diverted towards p38 activation. P38 may protect prostate tumoral cells from TNF-α apoptosis induced. The aim of this study was study the role of p38 in vivo (were evaluated some p38 downstream factors), as well as in vitro (in prostatic tumoral cell lines, LNCaP and PC3, pre-treated with TNF-α). Material and methods: Two prostatic tumoral cell lines (LNCaP and PC3) were used in in vitro studies. Two different experiments were made: with TNF-α (several concentrations) and p38 specific inhibitor (SB203580). The apoptotic index were evaluated using DAPI staining and flow cytometry. P38 activation was measured by Western blot analysis. 15 normal samples (NP) and 27 prostate cancer samples (PC) were used in in vivo study, all of them were processed for immunohistochemistry and Western-blot. Results: In vitro, TNF-α induced apoptosis in LnCap when we increased its concentration but not in PC3. TNF-α stimulation led to increase a time-dependent p38 phosphorylation in two intermediate doses whereas in PC3 not changes were found. In LNCaP after its preincubation with SB203580 and TNF-α treatment showed a significative increasing of apoptosis. In vivo, all NP samples were found positives to p-Elk-1 and p-ATF-2 (nuclei of epithelial cells). In PC the expression of p-Elk-1 or p-ATF-2 increased and was located in the nucleus and cytoplasm of epithelial cells. Conclusion: Our data in vitro and in vivo suggest that p38 plays a very important role in prostatic tumour progression. These data suggest that the control activation of p38 might be a possible target to cancer prostate treatment. Keywords: Prostate cancer. TNF-α. p38. LNCaP. PC3. 769 M. Ricote Belinchón, et al./Actas Urol Esp 2005; 29 (8): 769-776 E l papel de las citoquinas en el cáncer de próstata es muy poco conocido. En concreto, TNF-α es un miembro vital de la superfamilia del TNF que desempeña un papel muy importante en el sistema inmune, remodelación celular, apoptosis y supervivencia celular1. TNF-α desempeña un papel multifuncional y a veces opuesto en la evolución y el tratamiento del cáncer. Lejeune et al.2 observaron que la administración local de altas dosis de TNF-α destruían selectivamente los vasos sanguíneos del tumor y por lo tanto su gran poder anticancerígeno en melanoma. Sin embargo, diferentes estudios sugieren que TNF-α endógeno está implicado en el crecimiento de las células tumorales y en las interacciones con el estroma que facilitan la invasión tumoral y el desarrollo de metástasis3,4. Uno de los aspectos más importantes de la regulación de la muerte celular son las proteínas activadas por mitógenos (MAPKs)5. En mamíferos esta familia de proteínas la componen principalmente tres miembros: JNK, p38 y ERK. Aunque hay múltiples excepciones JNK y p38 se han relacionado con la inducción de apoptosis mientras que ERK con mitogénesis y de manera inversa con apoptosis5. TNF-α induce apoptosis cuando interacciona con su receptor de tipo I (TNFRI), el cual va a unir la molécula adaptadora al dominio de muerte celular (TRADD), la unión de ambas proteínas provoca la activación de toda una cascada de transducción intracelular mediada por fosforilaciones sucesivas (TRAF-2, ASK-1, MEK-4, JNK y AP-1)6 (Fig. 1). Pero la unión TNFRI-TRADD también puede desencadenar una señal intracelular que promueve la supervivencia celular y la inhibición de la apoptosis mediante la activación del factor nuclear-kB (NF-kB)7. Además, la vía de señalización TNF-α/AP-1 cuenta con dos intermediarios que son capaces de activar p38: ASK-1 (que fosforila MEK-6) y MEK-4 (que fosforila directamente p38)8. Por esta diversidad en cuanto a las señales que es capaz de inducir TNF-α, nos propusimos estudiar las diferentes rutas que promueven la activación de las MAPKs (JNK y p38), así como algunas dianas proteicas (factores de transcripción) in vivo (mediante inmunohistoquímica y Western blot en muestras procedentes de pacientes con cáncer de próstata) e in vitro (en las líneas celulares tumorales de próstata humana LNCaP y PC3). TNF IL-1 IL-1R1 Rac TNFR1 Cdc 42 M. plasmática TRADD PAK-1 TRAF2 MEK-6 p38 ASK1 MEK4 JNK Elk-1 ATF-2 Citoplasma AP-1 Núcleo FIGURA 1. Ruta de transducción inducida por TNF-α e IL-1. MATERIALES Y MÉTODOS La experimentación in vitro se realizó con dos líneas c (...truncated)