Study on virulence factors associated with biofilm formation and phylogenetic groupings in Escherichia coli strains isolated from patients with cystitis

ARTIGO/ARTICLE Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical 42(1):58-62, jan-fev, 2009 Estudo dos fatores de virulência associados à formação de biofilme e agrupamento filogenético em Escherichia coli isoladas de pacientes com cistite Study on virulence factors associated with biofilm formation and phylogenetic groupings in Escherichia coli strains isolated from patients with cystitis Monique Ribeiro Tiba1, Gustavo Prado Nogueira1 e Domingos da Silva Leite1 RESUMO Amostras de Escherichia coli, isoladas de pacientes do sexo feminino com quadro clínico de cistite, foram caracterizadas quanto à presença de fatores de virulência associados à formação de biofilme e ao agrupamento filogenético. Os resultados da reação em cadeia da polimerase demonstraram que todas as amostras foram positivas para o gene fimH (fímbria do tipo1), 91 amostras foram positivas para o gene fliC (flagelina) 50 amostras positivas para o gene papC (fímbria P), 44 amostras positivas para o gene kpsMTII (cápsula) e 36 amostras positivas para o gene flu (antígeno 43). Os resultados dos ensaios de quantificação da formação de biofilme demonstraram que 44 amostras formaram biofilme em microplacas de poliestireno e 56 amostras apresentaram resultado ausente/fraco. Também confirmamos a incidência das amostras de Escherichia coli no grupo filogenético B2 e D. Palavras-chaves: Escherichia coli uropatogênica. Reação em cadeia da polimerase. Biofilme bacteriano. ABSTRACT Escherichia coli samples isolated from female patients with cystitis were characterized with regard to the presence of virulence factors associated with biofilm formation and phylogenetic groupings. Polymerase chain reaction results demonstrated that all the samples were positive for the gene fimH (type 1 fimbriae), 91 for fliC (flagellins), 50 for papC (P fimbriae), 44 for kpsMTII (capsules) and 36 for flu (antigen 43). The results from assays to quantify the biofilm formation demonstrated that 44 samples produced biofilm on polystyrene microplates and 56 samples produced weak or no biofilm. We also confirmed that Escherichia coli samples were present in phylogenetic groups B2 and D. Key- words: Uropathogenic Escherichia coli. Polymerase chain reaction. Bacterial biofilm. Escherichia coli uropatogênica (UPEC) é o principal agente que ocasiona infecções no trato urinário (ITU), além de ser uma das fontes mais comuns de bacteremia em indivíduos hospitalizados17. Este agente é responsável por 80% das ITUs, sendo que, 95% de todas estas infecções, desenvolvem-se em uma rota ascendente12. Dentre os principais fatores de virulência, presentes no estabelecimento da infecção no trato urinário, estão as adesinas (fímbria do tipo 1, fímbria P, fímbria S, adesinas Afa/Dr), que promovem a colonização e formação de biofilme15. 1. Laboratório de Antígenos Bacterianos II, Departamento de Microbiologia e Imunologia, Instituto de Biologia, Universidade Estadual de Campinas, Campinas. SP. Apoio financeiro: Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo – FAPESP (Processo 05/02473-4) e Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES. Endereço para correspondência: Dr. Domingos da Silva Leite. Laboratório de Antígenos Bacterianos II, Depto de Microbiologia e Imunologia, IB/UNICAMP. Cidade Universitária Zeferino Vaz, 13081-970 Campinas, SP. Tel: 55 19 3521-6272. e-mail: Recebido em:5/09/2008 Aceito em 09/12/2008 58 Escherichia coli uropatogênica também tem sido encontrada formando biofilme bacteriano, que confere importantes vantagens aos microrganismos como resistência à desidratação e oxidação e maior tolerância a detergentes e antibióticos2 6. Diversas linhagens de Escherichia coli patogênica ou comensais são capazes de colonizar superfícies pela expressão de estruturas de adesão como flagelo, pili conjugativo, polissacarídeos extracelulares e curli, formando o biofilme bacteriano2. Foi descrito o papel da adesina antígeno 43 (Ag43), atuando na persistência da UPEC no trato urinário21. A expressão do Ag 43, codificada pelo gene flu, resulta em auto-agregação das células, promovendo a formação de biofilme bacteriano e a sobrevivência e persistência da bactéria durante uma infecção prolongada9. A expressão da fímbria do tipo 1 tem sido reportada por ser esta uma importante estrutura para formação do biofilme, devido sua adesão celular inicial23. Enquanto a adesão mediada pela fímbria do tipo 1 é importante durante os estágios iniciais de colonização, a motilidade e quimiotaxia do flagelo bacteriano permitem que a UPEC se dissemine para novos sítios do trato urinário, tanto para obter nutrientes quando estes se tornam limitados, quanto para escapar da resposta imune do hospedeiro10. Como as infecções do trato urinário ocorrem de Tiba MR cols maneira ascendente, tem-se sugerido que a motilidade mediada pelo flagelo contribua para a virulência das bactérias, uma vez que permite a disseminação bacteriana no trato urinário10. Os polissacarídeos capsulares são produzidos por muitas UPEC e estão associados à proteção contra a fagocitose, além de contribuírem para a formação de biofilme na bexiga14. Porém, estudos demonstram que a expressão da cápsula é reduzida na formação do biofilme, por mascarar outras estruturas de superfície18. Estudos epidemiológicos moleculares demonstraram que amostras de Escherichia coli podem ser divididas em quatro grupos filogenéticos designados A, B1, B2 e D3. Amostras que causam infecções extra-intestinais, como ITU, meningite e septicemia, têm sido classificadas no grupo B2, ou, menos frequentemente, no grupo D24. Amostras dos grupos B2 e D são conhecidas por possuírem mais fatores de virulência do que as amostras pertencentes aos grupos A e B116. O objetivo deste trabalho foi caracterizar genotipicamente 100 amostras de Escherichia coli uropatogênicas, quanto aos fatores de virulência associados à formação de biofilme, bem como demonstrar em ensaios fenotípicos a formação de biofilme e motilidade. Além disso, foi realizado o estudo do agrupamento filogenético das cepas de Escherichia coli uropatogênicas. MATERIAL E MÉTODOS Amostras bacterianas. Foram utilizadas 100 amostras de Escherichia coli, coletadas na década de 1990, e isoladas de pacientes do sexo feminino, atendidas nos ambulatórios do Hospital das Clínicas da Universidade de Campinas (UNICAMP), Campinas, São Paulo, apresentando quadro clínico de cistite. Foram excluídas as pacientes, que no momento da coleta, apresentassem febre, e/ou mal estado geral que pudesse caracterizar suspeita clínica de pielonefrite aguda ou qualquer quadro infeccioso. Pacientes com anomalias do trato urinário, ou qualquer doença de base também foram excluídos. O diagnóstico de cistite foi baseado pelos sintomas clínicos típicos como ardor à micção, polaquiúria, urgência urinária e/ou perda urinária de esforço e urocultura com contagem de colônias superior a 105UFC/ml, com crescimento de um único tipo de microrganismo. Estas amostras são pertencentes à Bac (...truncated)