Interferenz von Licht macht einzelne unmarkierte Proteine sichtbar

732 W I S S ENS CH AFT · S PECIA L : CELL IMAGI NG iSCAT-Mikroskopie Interferenz von Licht macht einzelne unmarkierte Proteine sichtbar KATHARINA KÖNIG 1 , ANDRÉ GEMEINHARDT 1 , VAHID SANDOGHDAR 1, 2 1 MAX-PLANCK-INSTITUT FÜR DIE PHYSIK DES LICHTS, ERLANGEN 2 DEPARTMENT PHYSIK, FRIEDRICH-ALEXANDER-UNIVERSITÄT ERLANGENNÜRNBERG, ERLANGEN iSCAT microscopy is a powerful tool for the optical detection and visualization of small nanoparticles, down to single unlabeled proteins. In this overview, we give an introduction to the method´s principles and benefits and show how it can be applied to monitor protein secretion of single living cells with single-protein sensitivity at millisecond temporal resolution. DOI: 10.1007/s12268-019-0225-9 © Die Autoren 2019 ó Der menschliche Körper ist ein komplexer Organismus, dessen Funktionsweise auf einer äußerst vielschichtigen und detaillierten Kommunikation verschiedenster Zelltypen über eine Vielfalt an Botenstoffen beruht. Um diese Prozesse zu verstehen und möglichen Fehlfunktionen vorzubeugen oder diese zu behandeln, ist es notwendig, die zellulären A B C Abläufe im Detail zu untersuchen. Eine kritische Komponente stellt dabei die Sekretion von Proteinen durch (stimulierte) Zellen dar, die beispielsweise innerhalb des Immunsystems eine wichtige Rolle spielt. Hier können diese Proteine von anderen Zellen wahrgenommen werden und verschiedene Reaktionen und Prozesse in der Immunabwehr auslösen. Die Untersuchung solcher Sekretionsprozesse birgt einige Herausforderungen. Traditionelle Methoden, wie Massenspektrometrie, antikörperbasierte Nachweisverfahren (z. B. ELISA) oder Durchflusscytometrie (z. B. FACS), sind sehr aufwendig, langwierig und benötigen das Markieren der Probe mittels Isotopen oder fluoreszenten Molekülen. Das Markieren von Proteinen ist weitverbreitet und für einen Großteil der biologisch moti- ¯ Abb. 1: Prinzip der iSCAT-Mikroskopie. A, Aufbau: Weitfeldbelichtung der Probenoberfläche mit einem Laser, Aufsammeln des teilweise reflektierten Lichts sowie eines Teils des vom Teilchen gestreuten Lichts mit dem Objektiv und Umlenkung auf einen Kamerasensor. B, von der Kamera registriertes Interferenzsignal zweier einzelner Proteine. Maßstab: 1 μm (aus [8]). C, Der iSCATKontrast skaliert linear mit der Masse des Proteins (aus [5]). BIOspektrum | 07.19 | 25. Jahrgang 733 vierten Mikroskopie unumgänglich. Jedoch führt das Einbringen eines Markers zwangsläufig zu einem Eingriff in den biologischen Prozess und zu einem gewissen Filter, der Proteine, die nicht markiert und vielleicht nicht bekannt sind, buchstäblich unerkannt im Dunkeln lässt. Die Sensitivität der genannten Methoden liegt in der Regel weit oberhalb von einzelnen Molekülen und erfordert häufig den Einsatz von ganzen Ensembles von Zellen, um eine zur Detektion ausreichende Menge an Proteinen zur Verfügung zu stellen. Dies steht jedoch oft im Widerspruch zu dem Wunsch, Messungen an einzelnen Zellen vornehmen zu können, um fundamentale Prozesse leichter zu isolieren und verstehen zu können. Das Ziel sind also Techniken, die in der Lage sind, ganz ohne den Bedarf an Markern einzelne Proteine in Echtzeit aufzulösen. In den vergangenen Jahren wurden verschiedene Methoden in diese Richtung entwickelt. Die Verwendung von komplexen nano-optischen Techniken, basierend auf verschiedenen Technologien, wie oberflächen- verstärkte Raman-Spektroskopie (SERS), Plasmonik oder Mikroresonatoren, erreichen heute die nötige Empfindlichkeit für die Detektion einzelner Proteine [1]. Diese Methoden beruhen jedoch – neben der Notwendigkeit von Oberflächenfunktionalisierung – auf der elektromagnetischen Feldverstärkung in einem sehr kleinen Sensorbereich und erfordern zudem oft eine statistische Interpretation des Signals. Dabei ist es durchaus möglich, einzelne Proteine direkt zu visualisieren, und zwar einzig über das Streusignal, das bei der Beleuchtung eines solchen Moleküls (etwa mit einem Laser) entsteht. Dieses an sich sehr schwache Signal kann mittels Interferenz detektiert werden, indem man es mit einem Referenzsignal überlagert und damit verstärkt. Die interferometrische Detektion von gestreutem Licht, kurz iSCAT (interferometric detection of scattered light), wurde 2004 in unserer Gruppe entwickelt [2] und unter anderem zur Detektion von Viren auf einer Membran genutzt [3]. Die Methode wird seither stetig weiterentwickelt und findet sich mittlerweile – in teils abgewandelter Form und verschiedensten Anwendungsbereichen – in den Experimenten zahlreicher Gruppen weltweit wieder [4]. Die Detektion gestreuten Lichts wird auch in der Dunkelfeldmikroskopie angewendet. Die Grundidee ist simpel: Das zum Beleuchten der Probe verwendete Licht wird nicht zum Auge bzw. der Kamera weitergeleitet, sondern abgeblockt, etwa durch eine Blende im Mikroskop oder eine schräg einfallende Beleuchtung. Lediglich das an der Probe gestreute Licht erreicht den Detektor. Hier zeigt sich jedoch ein fundamentales Problem: Der Streuquerschnitt und damit die Intensität des gestreuten Lichts skaliert mit dem Quadrat der Polarisierbarkeit des Teilchens. Diese ist wiederum abhängig vom Brechungsindex des Teilchens relativ zu dem seiner Umgebung sowie vom Teilchenvolumen. Da Teilchen mit einem Durchmesser, der deutlich kleiner als die Wellenlänge des Lichts ist, hier als Kugel betrachtet werden können, zeigt sich, dass ein Teilchen mit einem Durchmesser von fünf Nano- 734 W I S S ENS CH AFT · S PECIA L : CELL IMAGI NG A B ˚ Abb. 2: Prinzip der Zellsekretionsmessung mit iSCAT. A, Platzierung einer einzelnen, lebenden Zelle nahe der iSCAT-Sensorfläche. B, Histogramme der detektierten Proteine (Anzahl: 503) einer Zellmessung über 125 Sekunden auf einer nicht-funktionalisierten Oberfläche (blau) sowie auf einer antiIgG-funktionalisierten Oberfläche (schwarz) im Vergleich zu reinem IgG auf einer nicht-funktionalisierten Oberfläche (rot) (aus [8]). ¯ Abb. 3: Sekretionsdynamik einer einzelnen, lebenden Zelle unter stetigem Anstieg des pHWertes des umgebenden Mediums. Drei unterschiedliche Bereiche kennzeichnen die Sekretion einer intakten Zelle, einer gestressten Zelle unter erhöhtem pH-Wert und die Detektion von Teilen des Zellinneren auf der Sensoroberfläche nach Eintreten des Zelltods und Auflösen der Zellmembran (verändert nach [8]). metern (etwa ein Protein) im Vergleich zu einem Teilchen mit 50 Nanometer Durchmesser (etwa ein Virus) tatsächlich eine Million Mal weniger Licht streut. Damit fällt das Streusignal eines Proteins weit unter das detektierbare Niveau in der Dunkenfeldmikroskopie. Um das mit sinkender Teilchengröße drastisch abfallende Streusignal noch detektieren zu können, wird es in der iSCAT-Mikroskopie nun mit einer Referenzwelle zur Interferenz gebracht. Gleichung 1 zeigt die Intensität am Detektor: → → Idet ∝ |Eref + Es|2 = → → → → |Eref|2 + |Es|2 + 2|Eref||E s| cos θ. (1) → Hier ist Eref das elektrische Feld der Referenz→ welle und Es ∝ α das elektrische Feld der vom T (...truncated)