APLICACIÓN DE SALES DE TETRAZOLIO DE NUEVA GENERACIÓN (XTT) PARA LA ESTIMACIÓN DE LA DENSIDAD DE MICROORGANISMOS DEGRADADORES DE HIDROCARBUROS EMPLEANDO LA TÉCNICA DEL NÚMERO MÁS PROBABLE

Acta biol. Colomb., Vol. 15 N.º 3, 2010 75 - 90 APLICACIÓN DE SALES DE TETRAZOLIO DE NUEVA GENERACIÓN (XTT) PARA LA ESTIMACIÓN DE LA DENSIDAD DE MICROORGANISMOS DEGRADADORES DE HIDROCARBUROS EMPLEANDO LA TÉCNICA DEL NÚMERO MÁS PROBABLE Application of the New Generation Tetrazolium Salt (XTT) for the Enumeration of Hydrocarbon Degrading Microorganisms Using the Most Probable Number Method VICTORIA EUGENIA VALLEJO1,2, M.Sc.; HABIB YANINE1, FABIO AUGUSTO ROLDÁN.1, Ph. D. 1 Centro de Investigaciones y Estudios en Biodiversidad y Recursos Genéticos – CIEBREG. Laboratorio de Unidad de Saneamiento y Biotecnología Ambiental – USBA, Facultad de Ciencias. Pontificia Universidad Javeriana. Carrera 7 # 43-82, Bogotá D.C., Colombia. 2 Correspondencia: Presentado 6 de agosto de 2009, aceptado 28 de enero de 2010, correcciones 1 de septiembre de 2010. RESUMEN El presente estudio evaluó el desempeño de dos sales de tetrazolio, una tradicional: INT y una de nueva generación: XTT, para estimar la densidad de microorganismos degradadores de hidrocarburos (HCs) en suelos empleando la técnica del Número Más Probable (NMP). Se analizaron 96 muestras de suelo provenientes de la Ecorregión Cafetera de Colombia. Los microorganismos fueron recuperados en agar mínimo de sales en atmósfera saturada de HCs y la capacidad degradadora fue confirmada por repiques sucesivos utilizando diesel como fuente de carbono. No se observaron diferencias significativas en los recuentos de microorganismos degradadores obtenidos con las dos sales (t de Student, p<0,05), pero el XTT permitió mejor visualización de los pozos positivos dada la solubilidad del producto reducido, mientras que el INT produjo precipitación, debido al formazán insoluble generado, dificultando su lectura. Se obtuvo un mayor porcentaje de aislamientos empleando XTT (67%), lo cual podría indicar que el tipo de sal es determinante en la viabilidad de estas bacterias. Adicionalmente, se evaluó el límite de detección celular, las condiciones óptimas de concentración de XTT y el tiempo de incubación necesario para la detección de actividad degradadora utilizando la cepa Acinetobacter sp. El aumento en la concentración de XTT de 0,5 mM a 2 mM y el tiempo de incubación tuvieron un efecto inhibitorio y favorable respectiva-mente, en la recuperación de células viables, adicionalmente, límite de detección de la técnica fue de 102 UFC/ml. Palabras clave: INT, XTT, NMP, microorganismos degradadores de hidrocarburos, sales de tetrazolio. 76 Artículo - Aplicación de sales de tetrazolio de nueva generacion (XTT) para la estimación de la densidad de microorganismos degradadores de hidrocarburos empleando la técnica del número más probable. Vallejo, et ál. ABSTRACT The objective of this study was to evaluate the performance of two tetrazolium indicators: a traditional one: INT and a new generation one: XTT, for the estimation of hydrocarbon (HC) degrading microorganism’s density using the Most Probable Number Technique (MPN). Ninety six composite soil samples were taken and analyzed from Ecorregión Cafetera Colombiana. Degrading microorganisms were recovered in minimum salt medium with saturated HC atmosphere. Degrading HC capacity of the microorganisms was confirmed by successive subcultures in the same medium using diesel as only carbon source. Counts obtained with the two salts were not significantly different (Student t test, p<0,05) but XTT allowed an easier visualization of positive wells due to product solubility of the reduce product. A greater percentage of isolates was obtained using XTT (67%), which suggests that salt type is relevant for recovering of these microorganisms. Additionally, cell detection limit, optimal conditions of XTT concentration and incubation times for detection of activity were evaluated. This evaluation was performed by means of microplate format for hydrocarbon degrading microorganisms using Acinetobacter sp. An inhibitory effect was observed in the recovering of cultivable cells when XTT concentrations increased from 0,5 mM to 2 mM. Incubation time favored this recovering. Detection limit of this technique was established at 102 UFC/ml. Production of the XTT-formazan was positively related with initial cell concentration and negatively with incubation time. Key words: INT, XTT, MPN, hydrocarbon degrading microorganisms, tetrazolium salts. INTRODUCCIÓN La biorremediación es el proceso en el cual se emplean organismos para resolver problemas de contaminación ambiental, tales como la presencia de hidrocarburos totales de petróleo (TPHs) en ecosistemas marinos y terrestres. Este proceso se basa en la biodegradación, que es el fenómeno mediante el cual contaminantes como los hidrocarburos (HCs) se mineralizan hasta CO2 y agua al ser utilizados por los microorganismos como fuente de carbono y energía (Hamme et al., 2003). La estructura y composición de las comunidades microbianas presentes en ambientes naturales son las que determinan la velocidad a la cual se puede llevar a cabo el proceso de biodegradación (Gaskin y Bentham, 2005). Es por esto, que la estimación de la densidad bacteriana ha sido importante para describir, caracterizar y comparar la diversidad de comunidades bacterianas capaces de degradar diferentes tipos de HCs en distintos ambientes (Maila et al., 2006). La identificación de estos microorganismos ha sido relevante en biotecnología debido a su posible aplicación en el desarrollo de estrategias de biorremediación como la bioaumentación. Uno de los métodos más empleados en el monitoreo de los procesos de biorremediación de TPHs es la cuantificación de estas bacterias degradadoras de HCs. Numerosos estudios han utilizado la técnica de Número Más Probable (NMP) para estimar la densidad de microorganismos degradadores de HCs en sedimentos y muestras de suelo (Brown y Braddock, 1990; Roldán, 2002; Maldonado, 2004, Vallejo et al., 2005; Acta biol. Colomb., Vol. 15 N.º 3, 2010 77 Gaskin y Bentham, 2005). Esta técnica se convierte en un procedimiento alternativo al método de recuento en placa para la determinación de microorganismos viables. Con la técnica del NMP se han comparado el so de diferentes fuentes de HCs (p.e., kerosene, diesel, hidrocarburos policíclicos aromáticos-PAHs y crudo) en placas de 24, 60 y 96 pozos. Adicionalmente, se han empleado diferentes formas para visualizar la actividad metabólica de los microorganismos, como C14 radioactivo, pruebas de reducción con sales de tetrazolio o simplemente la aparición de turbidez en las diluciones (Wrenn y Venosa, 1996 y Haines et al., 1996). Las sales de tetrazolio permiten medir la actividad respiratoria asociada a la cadena transportadora de electrones. Estas sales presentan la ventaja de ser reducidas por la mayoría de los sistemas de deshidrogenasas, y de requerir cortos periodos de tiempo para su reducción y consecuente cambio de color (Gabrielson et al., 2002). Una de las sales más empleadas en estudios de biorremediación ha sido el INT (2-[ (...truncated)