Einblicke in die Entstehung von Mikrotubuli

145 Cytoskelett Einblicke in die Entstehung von Mikrotubuli STEFAN PFEFFER, ELMAR SCHIEBEL ZENTRUM FÜR MOLEKULARE BIOLOGIE DER UNIVERSITÄT HEIDELBERG (ZMBH), HEIDELBERG Microtubules are part of the cytoskeleton and promote various essential cellular functions. Microtubules are dynamic polymers composed of heterodimeric α/β-tubulin subunits and can assemble de novo in a ‘structural templating’ mechanism assisted by ring-like complexes containing the protein γ-tubulin. Recent cryo-electron microscopy structures of such γ-tubulin ring complexes from vertebrates propelled our understanding of their architecture, assembly and activation mechanism. DOI: 10.1007/s12268-020-1341-2 © Die Autoren 2020 ó Mikrotubuli sind Teil des Cytoskeletts und haben essenzielle Funktionen bei der mitotischen und meiotischen Chromosomenteilung, der Zellorganisation und bei vielen intrazellulären Transportvorgängen. Mikrotubuli sind zylindrische Proteinkomplexe mit einem Durchmesser von 25 Nanometern und einer Länge von bis zu 50 Mikrometern. Sie bestehen aus vielen Kopien des Heterodimers α/β-Tubulin, die in 13 geordneten Reihen, den Protofilamenten, angeordnet sind und so die Wandung des Zylinders bilden (Abb. 1). Die α/β-Tubulin-Dimere innerhalb eines Mikrotubulus haben alle die gleiche Orientierung und verleihen den Mikrotubuli dadurch eine eindeutige Polarität. Mikrotubuli sind sehr dynamische Strukturen, und vor allem das Plusende der Mikrotubuli kann durch Hinzufügen oder Entfernen von α/βTubulin-Untereinheiten verlängert oder verkürzt werden [1]. Besonders die Anzahl und Länge der Mikrotubuli sowie deren Ausrichtung innerhalb der Zelle können genau reguliert werden. Bäckerhefe besitzt ein minimales System für die MikrotubuliNukleation Schon vor fast 30 Jahren wurde das Protein γ-Tubulin als essenzieller Faktor für die ˚ Abb. 1: Schematische Darstellung des Aufbaus von Mikrotubuli (MT). α/β-Tubulin-Untereinheiten sind in 13 Reihen, den Protofilamenten, angeordnet und bilden die Wandung des MT-Zylinders. Die ersten und letzten Protofilamente sind durch einen Saum getrennt. α-Tubulin (dunkelgrau) bildet das Minusende, während β-Tubulin (hellgrau) das dynamische Plusende abschließt. BIOspektrum | 02.20 | 26. Jahrgang Assemblierung von Mikrotubuli aus α/βTubulin-Untereinheiten identifiziert [2]. Es wurde jedoch schnell klar, dass γ-Tubulin diese Funktion nicht allein, sondern im Zusammenwirken mit anderen Proteinen im Kontext eines größeren Proteinkomplexes erfüllt [3]. Mithilfe von genetischen Suppressorstudien in der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae wurden dann die Gene GCP2 und GCP3 als γ-Tubulin-Interaktoren identifiziert. GCP2 und GCP3 codieren für paraloge Proteine, die zusammen mit zwei γ-Tubulin-Untereinheiten den kleinen γ-Tubulin-Komplex (γ-tubulin small complex, γ-TuSC) bilden [4]. Strukturelle Untersuchungen unter Verwendung von Negativkontrast-Elektronenmikroskopie zeigten eine Y-ähnliche Anordnung der Untereinheiten, bei der die C-Termini von GCP2 und GCP3 jeweils mit einem γ-Tubulin-Molekül interagieren, während die N-Termini von GCP2 und GCP3 aneinanderbinden und so den γ-TuSC zusammenhalten (Abb. 2A, [5]). Untersuchungen zeigten, dass der γ-TuSC mit dem N-Terminus des Proteins Spc110 wechselwirken muss, um in einen mikrotubulinukleationskompetenten Zustand überführt zu werden [6]. Wie von K. Sawin beschrieben, besitzen Spc110 und weitere ähnliche Proteine ein kurzes gemeinsames Motiv, das als centrosomin motif 1 (CM1) bezeichnet wurde [7]. Die Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) zeigte, dass die Bindung von CM1 eine Oligomerisierung des γ-TuSC induziert, wobei eine linkshändige γ-TuSC-Helix entsteht (Abb. 2B, [8]). Die dreidimensionale Anordnung von γ-TubulinUntereinheiten in dieser Helix ist vergleichbar mit der Anordnung von α/β-TubulinUntereinheiten in einem Mikrotubulus. Basierend auf dieser Beobachtung und der bereits bekannten Interaktion zwischen α-Tubulin und γ-Tubulin wurde ein inzwischen weithin akzeptiertes Modell für die Mikrotubuli-Nukleation in Hefe vorgeschlagen, bei dem eine Helix aus sieben Kopien des γ-TuSC und Spc110 als optimale strukturelle Vorlage für die Assemblierung eines neuen Mikrotubulus aus α/β-TubulinUntereinheiten fungiert (Abb. 2C). 146 W I S S EN S CH AFT Das Mikrotubuli-Nukleationssystem gewinnt in anderen Organismen an Komplexität Das minimale Mikrotubuli-Nukleationssystem der Bäckerhefe, bestehend aus γ-TuSC und CM1-Proteinen, ist relativ einfach aufgebaut. Bereits in der verwandten Hefe Candida albicans wird ein zusätzliches essenzielles Protein, Mozart (Mzt1), für die Assemblierung einer γ-TuSC-Helix benötigt. In der Spalthefe Schizosaccharomyces pombe kommen weitere Komponenten hinzu. Neben den γ-TuSC-Komponenten und CM1-Proteinen wurden weitere zu GCP2 und GCP3 verwandte Proteine entdeckt, die als GCP4, GCP5 und GCP6 bezeichnet werden. Eine ähnliche Ausstattung an GCP-Genen gibt es auch in Aspergillus nidulans, Drosophila melanogaster, dem Krallenfrosch Xenopus laevis und in menschlichen Zellen. In S. pombe, A. nidulans und D. melanogaster ist die Mikrotubuli-Assemblierung über CM1-Proteine und γ-TuSCOligomere essenziell. Die GCP4–6-Gene scheinen in diesen Organismen dagegen eine eher untergeordnete Bedeutung zu haben. Im Gegensatz dazu reicht das minimale γ-TuSC/ CM1-System in Vertebraten überraschenderweise nicht für die Mikrotubuli-Nukleation aus. Diese übernimmt ausschließlich der im Aufbau wesentlich komplexere γ-TubulinRingkomplex (γ-TuRC), der aus den Proteinen GCP2–6, γ-Tubulin, der regulierenden Kinase NME7 und den Proteinen Mozart 1 und 2 besteht. Kryo-EM-Studien klären die Struktur des komplexen γ-TuRC aus Vertebraten auf Es war zwar bekannt, dass die verschiedenen GCP-Varianten im γ-TuRC in unterschiedlicher Kopienzahl vorkommen, jedoch war unklar, ob die relative Stöchiometrie und Anordnung der GCP-Varianten in allen γ-TuRC-Komplexen identisch ist. Weiterhin gab es keine Informationen darüber, welche Funktionen die einzelnen GCP-Moleküle im γ-TuRC erfüllen und ob das Template-Modell der γ-TuSC-Helix aus Bäckerhefe direkt auf den γ-TuRC übertragen werden kann. Um die Beantwortung dieser offenen Fragen voranzutreiben, wurden bereits seit dem Jahr 2000 Versuche unternommen, die Struktur des γ-TuRC aus höheren Eukaryoten durch KryoEM zu beschreiben [9]. Es kam jedoch erst im Jahr 2019 zum entscheidenden Durchbruch als die Struktur des humanen und X. laevis-γ-TuRC beschrieben wurde [10–12]. Diese Studien zeigten, dass der γ-TuRC die A B C ˚ Abb. 2: Schematische Darstellung der Mikrotubuli-Nukleation durch den γ-tubulin small complex (γ-TuSC) in Hefe. A, Zwei Moleküle γ-Tubulin und jeweils ein Molekül GCP2 und GCP3 formen den γ-TuSC. B, Die Interaktion des γ-TuSC mit dem CM1-Motiv in Spc110 führt zur Oligomerisierung von mehreren Kopien des γ-TuSC. In der entstehenden linkshändigen Helix wechseln sich GCP2 und GCP3 ab. C, Diese Anordnung dient als strukturelle Vorlage für die Assemblierung eines Mikrotubulus (MT (...truncated)