Molecular Genetic Diagnostics of Forest Plant Mycosis Agents, Transported by Insects

СИБИРСКИЙ ЛЕСНОЙ ЖУРНАЛ. 2014. № 4. С. 46–49 УДК 632.4:630*165.3 МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА ВОЗБУДИТЕЛЕЙ МИКОЗОВ ЛЕСНОГО ПОСАДОЧНОГО МАТЕРИАЛА, ПЕРЕНОСИМЫХ НАСЕКОМЫМИ © 2014 г. С. В. Пантелеев, О. Ю. Баранов Институт леса Национальной академии наук Беларуси Республика Беларусь, 246001, Гомель, ул. Пролетарская, 71 E-mail: , Поступила в редакцию 31.07.2014 г. Рассмотрены аспекты применения молекулярно-генетических методов в диагностике видового состава микромицетов в тканях насекомых с целью выяснения роли последних в качестве переносчиков возбудителей основных заболеваний древесных видов в лесных питомниках. Установлено, что насекомые являются одним из потенциальных факторов переноса и распространения ряда фитопатогенных грибов, в частности представителей родов Cladosporium и Alternaria. Ключевые слова: ДНК, ПЦР, посадочный материал, Cladosporium, Alternaria. тогенов у насекомых (Zhou et al., 2004; Persson et al., 2009). В настоящее время в лесном хозяйстве Беларуси отсутствуют данные о возможности распространения насекомыми возбудителей микозов лесных пород, что не позволяет в должной мере обеспечивать выявление и мониторинг потенциальных источников инфекции и осуществлять контроль эффективности проведения профилактических и карантинных мероприятий. Цель работы – молекулярно-генетическая диагностика и идентификация возбудителей трансмиссивных грибных заболеваний в лесных питомниках. В процессе питания помимо нанесения прямого ущерба растению насекомые представляют косвенную угрозу, выступая в качестве переносчиков инфекционных агентов для многих растительных видов. При этом перенос возбудителя может происходить как неспецифическим (на внешних покровах и в кишечном тракте), так и специфическим путями (на специализированных структурах) (Воронцов, 1982). Таким образом, насекомые-фитофаги являются потенциальными источниками инфекции. Основными характеристиками данного способа переноса патогенов являются высокая скорость распространения заболеваний, поражение как ослабленных, так и здоровых растений, возможность перемещения болезнетворных микроорганизмов на значительные расстояния и наличие видовой специализации возбудителей к переносчикам. В имеющихся литературных источниках представлено незначительное количество исследований в области трансмиссивных заболеваний лесных пород, а данные о переносе насекомыми фитопатогенных агентов являются разрозненными и неполными, что связано с отсутствием до настоящего времени соответствующих методов анализа, позволяющих выполнять диагностику фитопа- МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ Экспериментальный материал собран на территории пяти лесных питомников: Калинковичского, Мозырского опытного, Светлогорского, Быховского и Могилевского лесхозов и представлен насекомыми из четырех отрядов: Перепончатокрылые (Hymenoptera), Двукрылые (Diptera), Жесткокрылые (Coleoptera), Полужесткокрылые (Hemiptera) в общем количестве 200 шт., по 40 образцов с каждого объекта. Собраны также образцы пораженных тканей сеянцев ели ев46 Молекулярно-генетическая диагностика возбудителей микозов лесного посадочного материала, переносимых насекомыми сти в диапазоне от 520 до 2000 пар нуклеотидов. Полученные данные свидетельствовали о присутствии в исследуемых образцах одного и более видов грибов. При этом наряду с превалирующими вариантами ампликонов в ряде образцов отмечено присутствие нескольких минорных фракций, что указывало на наличие в данных пробах одновременно доминирующих и нескольких сопутствующих видов в следовых количествах. Альтернативные варианты ампликонов отобраны для проведения секвенирующей реакции. По результатам секвенирования ампликонов, выявленных в исследуемых образцах насекомых, получены следующие данные. По результатам анализа в Калинковичском лесхозе у 85 % образцов насекомых идентифицирован гриб Cladosporium sp., близкий по генетической структуре Cl. cladosporioides (Fresenius) de Vries (сходство нуклеотидной последовательности составило 98 %). Данный вид присутствовал в образцах представителей всех четырех исследуемых отрядов: Перепончатокрылые, Двукрылые, Жесткокрылые, Полужесткокрылые. Идентифицированный гриб является возбудителем кладоспориоза (оливковой плесени) широкого спектра лесных и сельскохозяйственных видов, поражающим растение на всех этапах развития – от семени до взрослого дерева. В единичных случаях у представителей отряда Двукрылые выявлен гриб Alternaria alternata (Fr.) Keissl., который является возбудителем альтернариоза (сухой пятнистости) многих видов растений (рис. 1). ропейской (Picea abies (L.) Karst.), сосны обыкновенной (Pinus sylvestris L.), туи западной (Thuja occidentalis L.), пихты сибирской (Abies sibirica L.), лиственницы европейской (Larix decidua Mill.) в общем количестве 200 образцов. Экспериментальный материал растений представлен хвоей с разной степенью поражения – от локального до полного побурения листовой пластинки. Методика исследования основывалась на использовании различных типов ДНК-маркеров, включая проведение секвенирования ДНК-локусов фитопатогенов. На основании проведенного сравнительного изучения пяти различных вариантов выделения ДНК из насекомых использован модифицированный CTAB-метод (Падутов, 2007). Амплификация маркерных регионов рибосомальной ДНК грибов проводилась методом полимеразной цепной реакции с использованием ПЦР-смеси PCR Green Mix (2Х) (Fermentas, Литва) согласно протоколу фирмы-изготовителя. В качестве области амплификации выбран регион рибосомальной ДНК 18S rRNA – ITS1 – 5,8S rDNA – ITS2 – 28S rRNA. Для проведения реакции амплификации использовались праймеры ITS1, ITS4 (White, 1990). Анализ продуктов амплификации производился путем электрофоретического фракционирования в 1,5%-м агарозном геле с последующим окрашиванием бромистым этидием. Для видовой идентификации грибов анализируемые ПЦР-зоны секвенировали с применением генетического анализатора ABI Prism 310 (Applied Biosystems) и набора BigDye Terminator Sequence Kit v.1.1 согласно протоколу компании-изготовителя. Нуклеотидная структура секвенированных ампликонов грибов анализировалась с помощью программы BLAST в международном генном банке NCBI (www.ncbi. nlm.nih.gov). РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ В ходе ПЦР-анализа, направленного на выявление в тканях насекомых грибной ДНК, получен электрофоретический спектр ампликонов, характеризующийся наличием нескольких фракций различной интенсивно- М 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 Рис. 1. Фрагмент ПЦР-спектра образцов микромицетов, выделенных у насекомых (Калинковичский лесхоз). 1–10, 12–17 – Cladosporium sp.; 11 – Alternaria alternata; М – электрофоретический стандарт. 47 С. В. Пантелеев, О. Ю. Баранов При этом в ряде образцов отмечено одновременное присутствие генетического материала двух и более видов грибов. В Калинковичском, Мозырском и Светлогорском лесхозах Гомельского государственного производственного лесохозяйственного объединения (ГПЛХО) на пораженных сеянцах и саженцах сосны и ели выявлены следующие доминирующие фитопатогены: Alt. alternata; Sclerophoma (...truncated)