Morphological observation of necroptosis after renal ischemia-reperfusion injury in rats

792 解放军医学杂志 论 著 2013年10月1日 第38卷 第10期 大鼠肾缺血再灌注损伤程序性坏死的形态学观察 李郭锦，张路，穆长征，宋小峰，郭敏 [摘要] 目的 观察大鼠肾缺血再灌注损伤程序性坏死的形态学变化。方法 应用免疫印迹技术、免疫组织化学 染色技术以及光学和电子显微镜技术对缺血60min再灌注24h的大鼠肾脏进行观察和分析。结果 免疫印迹分析结果 表明，与假手术组比较，大鼠肾缺血再灌注后受体相互作用蛋白激酶3(RIPK3)和肿瘤坏死因子受体α(TNFRα)表达增 强。缺血再灌注损伤的肾组织内出现RIPK3免疫组化染色阳性细胞，主要分布于肾小管上皮。光镜下皮质和髓质外带 的肾小管出现了程序性坏死，表现为细胞肿胀，着色苍白，细胞核固缩。电镜下程序性坏死表现为细胞质肿胀，细胞 器肿胀、破碎，含有一个凋亡样细胞核。结论 大鼠肾脏缺血60min再灌注24h后部分肾小管细胞发生了程序性坏死， 肾组织中RIPK3表达增强。 [关键词] 肾；再灌注损伤；程序性坏死；大鼠 [文献标志码] [中图分类号] R320.2345 [DOI] 10.11855/j.issn.0577-7402.2013.10.002 A [文章编号] 0577-7402(2013)10-0792-04 Morphological observation of necroptosis after renal ischemia-reperfusion injury in rats LI Guo-jin1, ZHANG Lu2, MU Chang-zheng3*, SONG Xiao-feng3, GUO Min3* 1 Department of Medical Imageology, Third Affiliated Hospital, Liaoning Medical University, Jinzhou, Liaoning 121001, China 2 Department of Nursing , Panjin Vocational and Technical College, Panjin, Liaoning 124010, China 3 Department of Histology and Embryology, Liaoning Medical University, Jinzhou, Liaoning 121001, China * Corresponding authors. Mu Chang-zheng , E-mail: ; GUO Min, E-mail: This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (31200871), Natural Science Foundation of Liaoning Province of China (201202141), and Science Foundation of Liaoning Medical University (20101311) [Abstract] Objective To observe the morphological changes of necroptosis after renal ischemia-reperfusion injury (RIRI) in rats. Methods Immunoblot analysis, immunohistochemical staining and light and electron microscope were used to observe and analyze necroptosis in the renal tissue after 60min ischemia and 24h reperfusion. Results Immunoblot analysis showed that the expression of receptor interacting protein kinase 3 (RIPK3) and tumor necrosis factor receptor α (TNFRα) in the kidney was significantly higher in RIRI group than in sham group. Immunohistochemical staining showed positive cells of RIPK3 in the kidney was evident in RIRI group, which distributed mainly in the renal tubular epithelium. Renal tubular cells undergoing necroptosis were evident in both cortical and outer region of the medulla after 60min ischemia and 24h reperfusion and morphologically featured by necrotic cytoplasm containing an apoptosis-like nucleus under electron microscope. Conclusion Necroptosis occurred in renal tubular cells and the expression of RIPK3 could increase in renal tubular cells in rat after 60min ischemia and 24h reperfusion. [Key words] kidney; reperfusion injury; necroptosis; rats 肾缺血再灌注损伤(renal ischemia-reperfusion i n j u r y ， R I R I ) 是 诱 发 急 性 肾 损 伤 (a c u t e k i d n e y injury，AKI)的主要原因，如肾移植、肾血管手术 [基金项目] 国家自然科学基金(31200871)；辽宁省自然科学基 金(201202141)；辽宁医学院博士启动基金(20101311) [作者简介] 李郭锦，硕士研究生。主要从事肾脏生物学方面 的研究 [作者单位] 121001 辽宁锦州 辽宁医学院附属第三医院影 像科(李郭锦)；124010 辽宁盘锦 盘锦市职业技术学院临床 护理系(张路)；121001 辽宁锦州 辽宁医学院组织胚胎学教 研室(穆长征、宋小峰、郭敏) [通讯作者] 穆长征，E-mail：； 郭敏，E-mail： 后都可发生RIRI，从而诱发AKI [1] 。大鼠常用于建 立RIRI引起的AKI动物模型，虽然有关大鼠RIRI引 起肾脏细胞损伤的报道很多，但多集中在细胞坏死 和细胞凋亡等 [2-3] 。近年来随着对细胞死亡机制研 究的深入，出现了从生物化学或分子生物学变化角 度分类和命名的新的细胞死亡方式。程序性坏死是 本世纪初由哈佛大学科研人员发现的一种细胞死亡 方式 [4-5] ，认为在程序性坏死过程中受体相互作用 蛋白激酶(receptor interacting protein kinase，RIPK) 的激活起着关键的介导作用。目前发现RIPK包括 RIPK1和RIPK3两种，二者为同源体，它们的激活 Med J Chin PLA, Vol. 38, No. 10, October 1, 2013 是细胞走向程序性坏死的关键 [6]。但程序性坏死是 否参与了肾缺血再灌注损伤，以及RIRI时RIPK3的 表达如何目前鲜见报道。本研究建立了RIRI大鼠模 型，应用免疫印迹分析、免疫组织化学染色以及光 镜、电镜技术对肾组织的程序性坏死进行观察，现 报告如下。 1 材料与方法 1.1 主要试剂及材料 羊抗大鼠肿瘤坏死因子受 体α(tumor necrosis factor receptor α，TNFRα)以及 RIPK3单克隆抗体(Abcam公司)；二抗试剂盒、DAB 显色试剂盒(北京中杉金桥生物有限公司)。 1.2 方法 1.2.1 动物及模型制备 健康SD大鼠10只，雌雄 各半，体重200～250g，由辽宁医学院实验动物中 心提供。按实验条件随机分为两组，每组5只。缺 血再灌注损伤(RIRI)组：苯巴比妥钠麻醉后开腹， 应用无损伤血管夹阻断双侧肾动脉血流60min后放 开；假手术(Sham)组：手术过程同前，但不阻断肾 动脉血流。两组动物关腹后于无菌条件下饲养24h 后取材。 1.2.2 取材 动物麻醉后经腹主动脉取血2ml用于 肾功能常规检查。切取新鲜右肾组织备用，用2.5% 多聚甲醛戊二醛经腹主动脉逆行灌流左肾，灌流成 功后于肾门处冠状面切开肾脏，一半用于常规石蜡 切片，另一半用于电镜标本制备。 1.2.3 RIPK3和TNFRα免疫印迹检测分析 两组新 鲜肾组织加入RIPA裂解液，0℃下剪碎，超声波粉 碎20s后静置30min，4℃下12 000r/min离心20min， 留取上清液，BCA法测定蛋白含量，并按每20μl含 50μg蛋白制成样品，－20℃冰箱保存。取已制备样 品适量加入电泳槽，100V电压下电泳，转膜，常 温下半干转印，TBST冲洗后，5%小牛血清白蛋白 室温封闭1～2h。分别加入一抗( RIPK3、TNFRα抗 体，稀释度为1 : 1000)4℃孵育过夜，TBST缓冲液洗 脱3次，每次5min，分别加入二抗(辣根过氧化酶标 记的IgG抗体，稀释度为1 : 200)室温孵育1h，TBST 缓冲液洗脱3次，每次5min，ECL发光显色，采用 β-actin作为内参。扫描电泳条带，凝胶分析软件分 析各目的蛋白条带吸光度( A )值。用目的条带与内 参条带A值的比值表示待测蛋白含量。 1.2.4 石蜡包埋切片的制备 用于石蜡切片的组织 经水洗后进行系列乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡定 向包埋(使切片呈冠状面方向)，4～5μm厚切片， 部分切片经HE染色，光镜观察，部分切片用于免 疫组织化学染色。 1.2.5 RIPK3的免疫组织化学染色 采用石蜡切片 793 免疫组化Envision法。切片常规脱蜡至水，3%过氧 化氢溶液处理30min去除内源性过氧化物酶，高压 修复抗原，滴加1 : 100稀释的RIPK3单克隆抗体， 4℃过夜，滴加辣根酶标记抗羊多聚体(PV9003)， 37℃孵育30min ，DA B显色。以上各步骤之间用 0.01mol/L PBS洗涤3次，苏木素复染，脱水，透 明，中性树胶封片，光镜下观察。阴性对照用PBS 替代一抗。蛋白阳性表达呈棕黄色。 1.2.6 电镜标本的制备 经2.5%多聚甲醛戊二醛固 定的肾组织再经1%锇酸后固定，缓冲液水洗3次， 每次15min，经梯度乙醇脱水、丙酮处理，采用树 脂Epon812包埋。超薄切片机行半薄切片，厚1μm， 甲苯胺蓝染色，光镜观察定位后再行超薄切片，厚 70nm，重金属双染色，EX1200透射电镜观察。 1.3 统计学处理 采用SPSS 13.0软件进行统计分 析，所有数据均以 x±s 表示，组间比较采用 t 检验。 P<0.05为差异有统计学意义。 2 结 果 2.1 肾功能检查结果 RIRI组动物血尿素氮为 39.1±2.7mmol/L，血清肌酐318±26mmol/L； Sham组动物血尿素氮为4.2±0.8mmol/L，血清肌酐 88±17mmol/L，说明肾缺血60min再灌注24h动物 肾功能处于衰竭状态。 2.2 免疫印迹检测分析结果 RIRI组大鼠肾组织 RIPK3和TNFRα蛋白表达(分别为0.6792±0.0379、 0.4062±0.0360)与Sham组(分别为0.0458±0.0132、 0.0554±0.0102)比较均明显增强(P<0.05，图1)。 2.3 光镜观察结果 2.3.1 RIPK3免疫组织化学染色结果 Sham组肾组 织呈阴性反应；RIRI组肾组织RIPK3阳性部位出现 棕褐色沉淀，分布在近端小管和远端小管细胞近游 离面及侧基底膜胞质内(图2)。 2.3.2 肾组织学观察结果 如图3所示，Sham组肾 小管上皮细胞呈立方形，胞质嗜酸性，核大，染色 浅；RIRI组肾小管上皮细胞出现肿胀苍白，细胞轮 Sham RIRI RIPK3 TNFRα β-actin 图1 Fig.1 of rats 两组免疫印迹电泳条带 Protein products by immunoblot analysis in two groups 794 解放军医学杂志 2013年10月1日 第38卷 第10期 A 图2 Fig.2 B 两组RIPK3免疫组织化学染色结果(×400) Immunohistochemical staining of RIPK3 in two groups of rats (×400) A. Sham group; B. RIRI group 廓尚可辨认，部分细胞胞质呈大空泡状，固缩的核 位于空泡内(箭头所示)，说明RIRI时肾小管上皮细 胞发生了特殊的细胞死亡，即程序性坏死。 2.4 电镜观察结果 Sham组肾小管上皮细胞结构 正常，细胞呈立方形或锥体形，核染色质疏松，线 粒体等细胞器结构正常；RIRI组肾小管上皮细胞出 现程序性坏死，表现为细胞核染色质固缩，细胞质 肿胀，细胞器如线粒体等也肿胀破碎，有时崩解并 大量减少，易与周边坏死细胞区别(图4)。 3 A B 图3 两组肾组织学观察结果(HE ×400) Fig.3 Histopathologic change of renal tissue in two groups of rats (HE ×400) A. Sham group; B. RIRI group A 图4 Fig.4 讨 论 大鼠肾缺血60min再灌注24h是国内外学者常用 的RIRI引致AKI动物模型 [7-8]，本研究结果确认了这 一动物模型的建立，肾缺血60min再灌注24h大鼠肾 功能处于衰竭状态。 程序性坏死是2008年由哈佛大学科研人员发 现的新的细胞死亡方式 [4]，2012年被国际细胞死亡 分类命名委员会正式接受 [5] ，其形态特点为坏死 样细胞质含有一个凋亡样的细胞核(apoptosis-like B C 两组肾小管上皮细胞电镜图像(×5000) Electron micrographs of proximal tubule cells in two groups of rats (×5000) A. Sham group; B, C. RIRI group nucleus)，前者表现为细胞质肿胀，细胞器如线粒 体等也肿胀变性，严重时细胞器崩解消失，后者表 现为核染色质固缩，有时边聚 [9]。本研究在光镜和 电镜下观察到上述程序性坏死出现在缺血再灌注损 伤的肾小管上皮细胞，说明缺血60min再灌注24h可 引起肾小管上皮细胞发生程序性坏死。 有研究认为TNFRα是启动程序性坏死的死亡 受体之一，导致程序性坏死的细胞外信号是通过 TNFRα接受并组合后导致RIPK激活的，由此细胞 发生程序性坏死 [4-6] 。本研究的免疫印迹检测结果 显示，TNFRα蛋白在缺血60min再灌注24h的肾组 织表达增强，提示TNFRα可能是RIRI时引起程序性 坏死的死亡受体。 有学者认为在程序性坏死过程中，RIPK的激 活起着关键的介导作用 [5-6] ，即RIPK激活后细胞发 生程序性坏死的可能性增加，因此可作为判定程序 性坏死的参考生物指标，也有人认为RIPK激活引 起的细胞死亡可称为RIPK介导的细胞死亡 [5-7]。 2012年，美国学者Linkermann等 [8]第一次揭示 了RIRI可引起肾小管上皮细胞发生RIPK1介导的细 胞死亡，同时应用免疫印迹分析发现RIRI时RIPK3 和RIPK1的表达均增强，但他们没有对RIRI的肾脏 进行RIPK3免疫组织化学染色和电镜下观察。本研 究结果发现，RIRI时RIPK3在肾小管免疫组化染色 的表现与Linkermann所见RIRI中RIPK1的表现是一 致的。有学者认为单一RIPK1激活不能完成程序性 坏死，只有RIPK1先行激活，等待RIPK3激活后二 者才形成necrosome，即坏死诱导复合体(n (...truncated)