Desinfección de cariopses y regeneración de plantas de Spartina argentinensis

Cien. Inv. Agr. 34(3): 231-236. 2007 www.rcia.puc.cl NOTA DE INVESTIGACION Desinfección de cariopses y regeneración de plantas de Spartina argentinensis Mirian S. Bueno1, Susana R. Feldman 1,2 y Juan P. Ortiz3 1 Cátedra de Biología, Facultad de Ciencias Agrarias, Universidad Nacional de Rosario, C.C. 14, s2125zaa Zavalla, Argentina. 2Consejo de Investigaciones de la Universidad Nacional de Rosario (CIUNR). 3Cátedra de Química Biológica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET). Abstract M.S. Bueno, S.R. Feldman, and J.P. Ortiz. 2007. Cariopsis disinfection and plant regeneration of Spartina argentinensis. Cien. Inv. Agr. 34(3): 231-236. A protocol for disinfection and in vitro regeneration of Spartina argentinensis was developed. The lowest percentage of contamination was obtained after treating caryopses with 90° ethanol for 60 s and 20 min immersion in 2.5% sodium hypochlorite (NaOCl) plus 0.1% Tween 20. Murashige and Skoog (MS) media was used for callus induction, supplemented with 0.5 mg·L-1 of 2, 4 dichlorophenoxy acetic (2,4-D) and 1 mg·L-1 of indole-3-acetic acid (IAA). The highest proportion (20%) of shoot regeneration was achieved with MS media plus 0.25 mg·L-1 of bencyl aminopurine (BAP), whereas 0.5 mg·L-1 naphtalenacetic acid (NAA) was used for root induction. Plants were regenerated via organogenesis. To our knowledge, this is the first report of a protocol for in vitro plant regeneration of S. argentinensis, and it is the initial stage required for obtaining somaclonal variations. Key words: In vitro regeneration, organogenesis, Spartina. Introducción El espartillo, Spartina argentinensis Parodi ((Poaceae: Chloridaeae), es una de las especies dominantes de las comunidades halófilas de distintas áreas de Argentina. Forma matas de altura variable, de 0,5 - 1,4 m de altura. Aunque produce abundantes panojas durante el verano, se reproduce principalmente en forma agámica por rizomas (Feldman, 2003). Los espartillares se utilizan para cría de ganado vacuno, a pesar del alto grado de lignificación de sus hojas, lo que reduce la digestibilidad. La obtención de líneas de espartillo caracterizadas por un menor contenido de lignina es una de las alternativas para mejorar la digestibilidad del forraje y al mismo tiempo mejorar la oferta forrajera en las áreas dónde esta especie se encuentra presente. Recibido 13 junio 2007. Aceptado 05 septiembre 2007. 1 Dirigir correspondencia a M. S. Bueno: Estudios previos (Larkin y Scowcroft, 1981) demostraron que durante las sucesivas mitosis que se producen en cultivo in vitro pueden ocurrir importantes modificaciones genéticas en las células. Algunas se manifiestan como mutaciones heredables, generando variaciones somaclonales. Por consiguiente, el cultivo de tejidos es una herramienta útil para el mejoramiento de especies vegetales y se ha utilizado en especies forrajeras nativas (Echenique et al., 2001; Kothari et al., 2005). La elección del explante es fundamental para el establecimiento de un cultivo in vitro (Roca y Mroginsky, 1991). En gramíneas se ha regenerado plantas utilizando embriones inmaduros, inflorescencias inmaduras y cariopses maduros (Dutta Grupta et al., 1999; Echenique et al., 2001). Sin embargo, algunos de estos explantes sólo se pueden obtener en determinadas épocas del año. En el género Spartina, se ha logrado regenerar plantas a partir de cultivo in vitro de cariopses maduros 232 CIENCIA E INVESTIGACION AGRARIA (Li et al., 1995, Li and Gallager, 1996; Wang et al., 2003). Sin embargo, en S. argentinensis, la contaminación de sus cariopses por Alternaria alternata, Fusarium graminearum y Bipolaris sorokiniana y otros hongos dificulta la utilización de los mismos para iniciar los cultivos. Algunos de estos hongos se han descrito como endógenos (Feldman et al., 2004). Este trabajo tuvo como objetivo estudiar diferentes tratamientos de desinfección de cariopses de espartillo (S. argentinensis) s y evaluar su potencial de regeneración in vitro. Materiales y métodos Se trabajó con cariopses maduros de S. argentinensis, sin pálea ni lemma, extraídos de panojas cosechadas en un espartillar ubicado en Pérez, provincia de Santa Fe, Argentina (32º 45’ S; 60º 35’ W). Se realizaron dos experimentos de desinfección de cariopses: 1. Inmersión durante 20 min en hipoclorito de sodio NaOCl al 1,5 y 2,5% (v/v) (Cloro Argentina S.A., 5,5 g·L-1 de cloro) con o sin el agregado de Tween 20 (0,1%). 2. Inmersión en NaOCl 2,5% con Tween 20 (0,1%) durante 20 o 30 min a temperatura ambiente con o sin inmersión en etanol 90° por 60 s. Se utilizaron cinco repeticiones por tratamiento, con 20 cariopses por repetición. Luego de cada tratamiento, los cariopses se lavaron con abundante agua estéril y se los sembró en placas de Petri con medio Murashigue Skoog (MS 1962), sin hormonas, suplementados con 30 g·L-1 de sacarosa, 7 g·L-1 de agar, pH 5,8. Los cultivos se incubaron en oscuridad a 23 ± 2°C durante 30 días. La proporción de cariopses contaminados a los 7 días de la siembra in vitro se evaluó mediante análisis de varianza (ANDEVA) y los promedios se separaron según Duncan (Statistica 5.0). Previo a los análisis, los valores porcentuales se transformaron en arcoseno √x. Los cariopses libres de contaminación se transfirieron a tubos de ensayo de 20 ml con diferentes medios para la inducción de callos (Cuadro 1) y se mantuvieron en oscuridad a 25° C, durante 30 días. Los callos producidos se repicaron a medios para la inducción de vástagos con diferentes concentraciones de bencil amino purina (BAP) y se incubaron a 25° C, con un fotoperíodo de 16 h (Cuadro 1). Los vástagos obtenidos se separaron y la regeneración de raíces se obtuvo en medio con ácido naftalen acético (ANA) (Cuadro 1). Las frecuencias de formación de callos y vástagos para los distintos medios ensayados, se compararon mediante prueba de homogeneidad con aplicación de Chi cuadrado (λ2) (SAS Institute, Cary, NC, EUA). Se realizaron estudios histológicos para determinar la vía de regeneración de los explantes. Las muestras se fijaron en FAA (10% formol, 5% ácido acético, 50% etanol y 35% agua) y posteriormente se deshidrataron en concentraciones ascendente de etanol (1 h en cada una de las siguientes soluciones de etanol: 70°; 80°; 90°, 96° y 30 min en 100°). Previo a la inclusión en parafina, las muestras se clarificaron con xilol, realizando un paulatino desplazamiento del etanol 100° por el xilol. Se realizaron cortes con micrótomo tipo Minot (1820 μm de espesor) y se colorearon con safranina (30 min) y fast-green (60 s), que tiñe de color azul-verdoso las zonas celulósicas y de color fucsia a las zonas lignificadas (Johansen, 1940, Dizeo de Strittmater, 1979). Los preparados montados con bálsamo de Canadá, se observaron y se fotografiaron con microscopio óptico. Cuadro 1. Composición de los medios de cultivo utilizados para inducción de callos (M), inducción de vástagos (V) y enraizamiento (R) de Spartina argentinensis. Table (...truncated)