Protocol for the combination of neurohistological techniques on vibratome obtained sections

Tamayo-Orrego Biomédica 2011;31:444-50 L, Torres-Fernández O Biomédica 2011;31:444-50 NOTA TÉCNICA Estandarización de un protocolo para la combinación de técnicas neurohistológicas en cortes obtenidos con vibrátomo Lukas Tamayo-Orrego, Orlando Torres-Fernández Laboratorio de Microscopía, Grupo de Morfología Celular, Subdirección de Investigación, Instituto Nacional de Salud, Bogotá D.C., Colombia Introducción. El estudio histológico del sistema nervioso ha requerido del uso de técnicas especiales. Esto se debe a que no existen métodos que permitan visualizar, simultáneamente, todos los constituyentes celulares del tejido nervioso. Objetivos. Adaptar un protocolo para llevar a cabo un método de coloración del tejido nervioso, previamente conocido pero poco utilizado hasta ahora, debido a las dificultades que presenta el procedimiento original. Materiales y métodos. Se trabajó con cortes de encéfalo y médula espinal de 4 mm de espesor, extraídas de ratones adultos previamente fijados mediante perfusión intracardiaca con paraformaldehído al 4 %. En un vibrátomo se obtuvieron cortes de 15 a 25 µm de espesor. Éstos se montaron sobre láminas portaobjeto preparadas con gelatina como adhesivo. Las preparaciones se sometieron al protocolo de coloración Luxol Fast Blue-PAS-Hematoxylin (LPH) y, su combinación, con un método de tinción argéntica (LPH-Holmes). Resultados. La técnica LPH permitió obtener una excelente diferenciación de la sustancia gris y la sustancia blanca en todas las regiones del sistema nervioso. En una vista panorámica, la sustancia gris se observa de color rosado, mientras que las fibras y tractos nerviosos con mielina se apreciaron de color azul claro. La combinación LPH-Holmes conservó las características de la tinción, pero mejoró ostensiblemente la demarcación de los axones y tractos. Conclusiones. Se estandarizó un protocolo para llevar a cabo la tinción LPH y su combinación LPHHolmes en cortes obtenidos con un vibrátomo. Éste es más corto, menos dispendioso y menos costoso que el original y, además, preserva mejor la integridad del tejido nervioso. Palabras clave: neuronas, neuroanatomía, sistema nervioso, tejido nervioso, técnicas histológicas, vaina de mielina. Protocol for the combination of neurohistological techniques on vibratome obtained sections Introduction. The histological study of the nervous system requires the use of special techniques. Currently, no methods are available to visualize simultaneously all the cellular constituents of nervous tissue. Objectives. A protocol was adapted for staining nervous tissue by modification of a formerly difficult procedure. Materials and methods. Slices of brain and spinal cord, 4 mm thick, were taken from adult mice, previously fixed by intracardiac perfusion with 4% paraformaldehyde. Vibratome sections were obtained with thickness of 15-25 μm. These were mounted on glass slides prepared with gelatin as an adhesive. The preparations were subjected to staining protocol Luxol Fast Blue-PAS-hematoxylin (LPH) combined with silver staining method (LPH-Holmes). Results. LPH technique yielded an excellent differentiation of gray and white matter in all regions of the nervous system. A panoramic view of the gray matter was colored pink in contrast to the myelinated nerve fibers and tracts which were light blue. The combination LPH-Holmes retained the staining characteristics but significantly improved the demarcation of axons and tracts. Conclusions. A protocol was standardized for the LPH and LPH-Holmes nervous tissue stains applied in combination to tissue slices obtained with a vibratome. The method was shorter, less wasteful and less expensive than the original and also better preserved the integrity of nervous tissue. Key words: neurons, neuroanatomy, nervous system, nerve tissue, histological techniques, myelin sheath. 444 Biomédica 2011;31:444-50 Desde sus orígenes, el estudio histológico del sistema nervioso ha requerido el uso de técnicas especiales, además de los procedimientos rutinarios (1). Esto se debe a que no existen métodos que permitan visualizar, simultáneamente, todos los constituyentes celulares del tejido nervioso: cuerpos neuronales, dendritas y axones, así como los diferentes tipos de células de la glía. El estudio detallado de cada uno de ellos ha conducido al desarrollo de procedimientos especiales (2-4). Entre éstos, se encuentran los métodos de plata reducida, las tinciones para mielina, las impregnaciones argénticas y las técnicas citoquímicas e inmunohistoquímicas. Algunos de estos métodos no hacen parte de los protocolos rutinarios en los laboratorios de diagnóstico neurohistopatológico, pero sí se utilizan para la investigación en neurociencias (5-8). En 1987, Goto estandarizó un procedimiento que reunía varios tipos de técnicas histológicas para discriminar diversos componentes del tejido nervioso (9). La tinción más importante del protocolo es la coloración Luxol Fast Blue-PASHematoxilin (LPH), una forma mejorada de la tradicional técnica de Klüver-Barrera (10) que, además de mostrar las estructuras vasculares y meníngeas, permite diferenciar la sustancia gris, rica en células, de la sustancia blanca, compuesta principalmente por axones y mielina. El uso del protocolo estandarizado por Goto no se extendió, probablemente, porque fue diseñado para tejido incluido en celoidina. Este medio de inclusión fue muy utilizado en la primera mitad del siglo XX, pero ha sido abandonado casi totalmente por ser un procedimiento largo y dispendioso y porque requiere de micrótomos especiales (3). En una breve revisión en Pubmed, se encontraron tan sólo una docena de referencias de artículos en los cuales se menciona el uso de la técnica LPH en estudios neurohistológicos, todos ellos publicados por su autor original. Por el contrario, en las últimas dos décadas se ha incrementado el uso de vibrátomos (micrótomos de vibración) en los laboratorios de neurociencias. Estos equipos permiten obtener Correspondencia: Orlando Torres-Fernández, Laboratorio de Microscopía, Grupo de Morfología Celular, Instituto Nacional de Salud, Avenida Calle 26 N° 51-20, Bogotá, D.C., Colombia. Teléfono: (571) 220 7700, extensión 1262 Recibido: 02/12/10; aceptado:30/03/11 Combinación de algunas técnicas neurohistológicas cortes relativamente gruesos (más de 10 μm de espesor), como los que antes se realizaban en celoidina, sin tener que procesar el tejido en medios de inclusión; por lo tanto, conservan muy bien la morfología y antigenicidad tisular, características importantes para llevar a cabo con éxito estudios con técnicas inmunohistoquímicas y de microscopía electrónica (11-15). Igualmente, el uso del vibrátomo ha permitido la adaptación y simplificación de protocolos neurohistológicos que eran ya poco utilizados, como la técnica de GolgiCox (16). Con estos antecedentes, se presenta un protocolo estandarizado en nuestro laboratorio que permite realizar y combinar varias coloraciones neurohistológicas en (...truncated)