Transkriptomik über Artgrenzen hinweg

381 Cross-Spezies-RNA-seq Transkriptomik über Artgrenzen hinweg ALEXANDER J. WESTERMANN INSTITUT FÜR MOLEKULARE INFEKTIONSBIOLOGIE (IMIB), UNIVERSITÄT WÜRZBURG; HELMHOLTZ-INSTITUT FÜR RNA-BASIERTE INFEKTIONSFORSCHUNG (HIRI), HELMHOLTZ-ZENTRUM FÜR INFEKTIONSFORSCHUNG (HZI) RNA sequencing has become a key technology to study microbemicrobe and host–microbe interactions and improved our understanding of the underlying mechanisms and physiological consequences. Here, focusing on our gut, I illustrate how metatranscriptomics and Dual RNA-seq approaches provide functional insights into increasingly complex cellular interactions and outline future directions in the field of “cross-species” transcriptomics. DOI: 10.1007/s12268-022-1773-y © Der Autor 2022 ó Die RNA-Sequenzierung (RNA-seq) ist ein mächtiges molekularbiologisches Werkzeug. Anders als sondenbasierte TranskriptomikMethoden (etwa Microarrays), löst RNA-seq Transkripte auf Einzelnukleotidebene auf. Dies bedeutet, dass RNAs, deren Sequenzen nur in wenigen Nukleotiden variieren, voneinander unterschieden werden können. Diese Präzision ermöglicht es, RNA-Moleküle innerhalb eines Probengemischs aus verschiedenen Organismen am Computer ihrem jeweiligen Ursprungsgenom zuzuordnen. Wir nennen dies „Cross-Spezies“-RNA-seq [1]. Ein gängiges Beispiel ist die Metatranskriptomik, die sich dieses Prinzip zunutze macht und RNA-Proben aus Mikrobengemeinschaften untersucht [2]. Ähnlich misst die duale RNA-Sequenzierung die gemeinsame Genexpression von Wirt und Erreger während einer Infektion [3]. Dies erspart die experimentelle Aufreinigung einzelner Zelltypen (oder deren RNA), worin auch die hohe Sensitivität solcher Cross-Spezies-Ansätze mitbegründet liegt, da kein Material in zusätzlichen Auftrennungsschritten verloren geht. Daneben werden die Proben zwar in der Regel gründlicher (d. h. tiefer) sequenziert als konventionelle cDNABanken, um alle beteiligten Transkriptome möglichst erschöpfend abzubilden. Dafür BIOspektrum | 04.22 | 28. Jahrgang reduzieren sich die Kosten für die Herstellung der cDNA-Proben gegenüber einer separaten Analyse, da die unterschiedlichen Transkriptome parallel in einer Reaktion umgeschrieben und prozessiert werden. Letzteres bietet auch einen analytischen Vorteil: Technisches Rauschen, das während der cDNA-Herstellung oder Sequenzierung mitunter entsteht, beeinflusst alle Transkriptome im selben Maße und lässt sich nachträglich leichter herausfiltern. Dieses verbesserte Signal-to-Noise-Verhältnis ermöglicht korrelative Genexpressionsanalysen über die Speziesgrenze hinweg, um letztlich kausale Zusammenhänge vorherzusagen. Ein Anwendungsbeispiel ist der menschliche Dickdarm, ein extrem dicht besiedeltes Ökosystem. Schätzungen zufolge leben dort etwa 1014 Bakterien; hinzu kommen Viren, Archaeen, Protisten und Pilze, die alle gemeinsam unsere Darmmikrobiota bilden. Diese Organismen wechselwirken mit der Darmmukus- und -epithelschicht sowie den intestinalen Immunzellen und helfen uns dabei, Krankheitserreger abzuwehren. ˚ Abb. 1: Übersicht einzelner Transkriptomik-Methoden anhand des menschlichen Darms (nach [1]). Metatranskriptomik analysiert Genexpressionsunterschiede in mikrobiellen Gemeinschaften. Dual und Triple RNA-seq messen die Genexpression von eukaryotischen Wirtszellen während ihrer Interaktion mit einem oder mehreren unterschiedlichen Mikroorganismen. Während diese Methoden bislang auf Populationsebene ansetzen (also RNA-Level über Millionen Zellen mitteln), liest die Einzelzell-RNA-seq Transkriptome einzelner Eukaryoten- bzw. neuerdings sogar einzelner Bakterienzellen aus. 382 W I S S EN S CH AFT · ME TH ODE N A B werden. Umgekehrt zeigen kinetische Studien, dass die Expression der mikrobiellen Gene im Zeitverlauf reguliert wird – vermutlich als Antwort auf externe Stimuli, wie etwa die Nahrungsaufnahme – und so innerhalb einer Person variabler ist als die SpeziesZusammensetzung, die über lange Zeiträume konstant ist [4]. Standardisierung und Vereinfachung der Probennahme, etwa mittels RNA-Fixierungsreagenzien, sowie Fortschritte in der bioinformatorischen Analyse der entstehenden Datenmassen werden Metatranskriptom-Studien weiter begünstigen und künftig tiefere Einblicke in die Rolle von Mikrobengemeinschaften für die Physiologie und Pathologie ihres Wirts liefern. Dual RNA-seq ˚ Abb. 2: Arbeitsabläufe einzelner Cross-Spezies-RNA-seq-Ansätze. A, Metatranskriptomik. B, Duale RNA-Sequenzierung. In beiden Fällen werden RNA-Gemische aus unterschiedlichen Organismen gemeinsam gesammelt und anschließend die resultierenden Sequenzier-Reads am Computer ihren jeweiligen Referenzgenomen zugeordnet. Während diese im Falle von Dual RNA-seq a priori bekannt sind, profitiert die Metatranskriptomik vom parallelen Sequenzieren der genomischen DNA der entsprechenden Bakteriengemeinschaft. Folglich eignet sich dieser Lebensraum besonders, um multilaterale Wechselwirkungen mittels Cross-Spezies-RNA-seq zu studieren (Abb. 1). Metatranskriptomik Das Sequenzieren von PCR-Produkten über variable Bereiche ribosomaler Loki (16S profiling) bzw. genomischer DNA-Fragmente (Shotgun-Sequenzierung) wird seit längerer Zeit eingesetzt, um die Zusammensetzung mikrobieller Konsortien zu bestimmen. Jedoch sagt die bloße Anwesenheit (oder Abundanz) eines Organimus’ wenig über dessen funktionalen Beitrag zur Aktivität der Gemeinschaft aus. Zunehmend populärer werden aus diesem Grund Metatranskriptomik-Ansätze [2]: Während Metagenomik lediglich die genomische Blaupause einer Mikrobengemeinschaft aufzeigt (also welche Gene vorhanden sind), gibt Metatranskriptomik auch Auskunft über die Aktivität dieser Gene und somit funktionale Einblicke in das jeweilige Konsortium. Metatranskriptomik-Ansätze ernten RNA aus mikrobiellen Gemeinschaften, wie etwa der Darmmikrobiota. Solche Studien haben in der Regel eine intra-kingdom-Ausrichtung, betrachten also häufig rein bakterielle Gemeinschaften. Wichtig hierbei ist, dass ein Lyseverfahren angewandt wird, das einerseits harsch genug ist, um nicht nur Gram- negative, sondern auch Gram-positive Bakterien mit ihrer dickeren Zellwand aufzuschließen. Dies kann mechanisch, enzymatisch, oder chemisch erfolgen. Andererseits muss der Aufschluss so schonend sein, dass die freigesetzte RNA nicht sofort degradiert. Nach erfolgter Lyse werden ribosomale RNAs entfernt, die restlichen Transkripte in komplementäre cDNA umgeschrieben und sequenziert (Abb. 2A). Im Fall der Darmmikrobiota werden somit mehrere Hundert (zum Teil eng verwandte) Spezies parallel beprobt. Aufgrund dieser genetischen Verwandtschaft können Genexpressionsstudien oft nur bis zur taxonomischen Ebene der Gattung aufgelöst werden. Bei vergleichenden Studien ist es hilfreich, wenn der jeweilige Metatranskriptom-Datensatz gegen die zugehörigen Metagenomdaten abgeglichen wird, da so zwischen Genexpressionsänderungen und Unterschiede in der Konsortien-Zusammensetzung differenziert werden kann. Welche Einsichten über unsere Darmmikrob (...truncated)