Terpenoidsynthese in dem phototrophen Bakterium Rhodobacter capsulatus

88 B I O T ECH NOLOGIE Photobiotechnologie Terpenoidsynthese in dem phototrophen Bakterium Rhodobacter capsulatus FABIENNE KNAPP, OLIVER KLAUS, VERA SVENSSON, ACHIM HECK, ANITA LOESCHCKE, THOMAS DREPPER INSTITUT FÜR MOLEKULARE ENZYMTECHNOLOGIE, UNIVERSITÄT DÜSSELDORF; FORSCHUNGSZENTRUM JÜLICH GMBH Terpenoids offer various properties relevant for biotech and pharma industries. Production in microbes is a sustainable way to provide these compounds for industrial use. The phototrophic bacterium Rhodobacter capsulatus has some unique characteristics making it a promising alternative host for terpenoid production. Recombinant biosynthetic pathways can be individually adapted through modular engineering to meet the specific requirements of each microbial terpenoid production process. Die Autoren widmen diesen Artikel Prof. Dr. Karl-Erich Jaeger für seine weitreichenden wissenschaftlichen Beträge auf dem Gebiet der molekularen Enzymtechnologie. DOI: 10.1007/s12268-023-1874-2 © Die Autorinnen und Autoren 2023 ó Die Klasse der Terpenoide, die häufig auch als Isoprenoide bezeichnet werden, bildet mit über 80.000 identifizierten Verbindungen eine der größten SekundärmetabolitGruppen [1]. Sie werden natürlicherweise von zahlreichen Mikroorganismen, Pflanzen und Tieren synthetisiert und sind zum Beispiel in ätherischen Ölen vieler Nutz- und Heilpflanzen zu finden. In der Natur vorkommende Terpenoide bestehen in der Regel aus einer variablen Anzahl von C5-Isopreneinheiten. Diese Grundbausteine werden in Pround Eukaryoten über zwei unterschiedliche Biosynthesewege, den 2-C-Methylerythritol4-phosphat(MEP)- sowie den Mevalonat (MVA)-Weg [2,3], erzeugt und anschließend durch enzymatisch katalysierte Kondensationsreaktionen miteinander verknüpft. Die so entstandenen Zwischenprodukte GPP (Geranylpyrophosphat), FPP (Farnesylpyrophosphat) bzw. GGPP (Geranylgeranylpyrophosphat) werden typischerweise anschließend in enzymatischen Schlüsselreaktionen beispielsweise zyklisiert oder chemisch „dekoriert“. Anhand der Anzahl der C5-Einheiten wird u. a. zwischen Mono(C10)-, Sesqui(C15)-, Di(C20)-, Tri(C30)- und Tetra(C40)- Terpenoi- den mit jeweils zwei, drei, vier, sechs beziehungsweise acht C5-Einheiten unterschieden [4]. Aufgrund ihrer strukturellen Diversität weisen Terpenoide eine Vielzahl von biotechnologisch und medizinisch relevanten Funktionen auf und werden daher in der Lebensmittel-, Futtermittel-, Kosmetik- und Pharmaindustrie beispielsweise als Duft-, Geschmacks-, Farb- oder Wirkstoffe eingesetzt. Bekannte Vertreter dieser Wert- und Wirkstoffklassen sind z. B. die Sesquiterpene Valencen, ein Aromastoff der Orange, und Artemisinin aus Artemisia annua (einjähriger Beifuß), welches erfolgreich als Wirkstoff gegen Malaria eingesetzt wird. Da die Extraktion von Terpenoiden aus Pflanzenmaterialien ein sehr zeit- und kostenaufwendiger Prozess sein kann, gibt es seit einiger Zeit zahlreiche Bestrebungen, diese Naturstoffe biotechnologisch in entsprechend modifizierten und optimierten Mikroorganismen zu produzieren. Neben dem Bakterium Escherichia coli und der Hefe Saccharomyces cerevisiae, die bereits heute in unzähligen industriellen Produktionsprozessen erfolgreich eingesetzt werden, rücken auch phototrophe Mikroorganismen als alternative Terpenoid- Produktionswirte immer mehr in den Fokus der Wissenschaft [5]. Rhodobacter sind vielversprechende alternative Terpenoidproduzenten Phototrophe Bakterien, wie die Nichtschwefelpurpurbakterien Rhodobacter capsulatus und Rhodobacter sphaeroides, können mittels anoxygener Photosynthese Licht als Energiequelle für die Fixierung von Kohlenstoffdioxid (CO2) und Luftstickstoff (N2) sowie für biotechnologische Produktionsprozesse nutzen [6]. Aufgrund des phototrophen Stoffwechsels weisen Rhodobacter-Zellen neben dem intrinsischen Carotinoid-Biosyntheseweg – diese Photopigmente gehört zu der Klasse der Tetraterpenoide und werden in großen Mengen in der Zelle synthetisiert – besondere morphologische Eigenschaften auf, die für die Synthese wirtsfremder Terpenoide von Vorteil sein können. Hierzu zählt die Ausbildung von intracytoplasmatischer Membranvesikel, die sowohl membranständige Enzyme als auch die hydrophoben Intermediate und Produkte der Terpen-Biosynthesewege aufnehmen und speichern können. Um Rhodobacter-Zellen für die Produktion von Terpenoiden umzuprogrammieren und zu optimieren, können verschiedene zelluläre Prozesse adressiert und in einem modularen Engineering-Konzept miteinander kombiniert werden (Abb. 1). Neben der Verbesserung der heterologen Genexpression werden so Maßnahmen ergriffen, die zu einem gerichteten Fluss der Stoffwechselintermediate innerhalb des rekombinanten Biosynthesewegs vom zentralen Kohlenstoffmetabolismus hin zur Zielverbindung führen. Heterologe Synthese verschiedener Terpenoide in Rhodobacter capsulatus In allen bislang evaluierten TerpenoidBiosynthese wegen führte die alleinige Expression des jeweiligen heterologen Terpensynthasegens in R. capsulatus zu einer sehr geringen Produktausbeute. Erst durch die Kombination einiger der in Abbildung 1 genannten Engineering-Module konnten in den letzten Jahren verschiedene wirtsfremde BIOspektrum | 01.23 | 29. Jahrgang 89 Tab. 1: Erfolgreich produzierte Terpenoide in Rhodobacter capsulatus, die angewandten Engineering-Strategien sowie die anwendungsrelevanten Eigenschaften der Produkte. Farben der Module siehe Abb. 1. Terpen Heterologe Synthase engineering Module Eigenschaften Valencen CnVS (Callitropsis nootkatensis) rotes, grünes & blaues Modul Geschmacks- und Duftstoff Patchoulol PcPS (Pogostemon cablin) rotes & grünes Modul Duftstoff β-Caryophyllen QHS1 (Artemisia annua) rotes & grünes Modul entzündungshemmende Wirkung; antiphytopathogen [11] Casben RcCS (Ricinius communis) grünes Modul antimykotisch [10] Squalen McSQS (Methylococcus capsulatus) gelbes, grünes & blaues Modul Antioxidationsmittel und Impfstoffzusatz [7, 10] Cycloartenol CAS1 (Arabidopsis thaliana) rotes, blaues & oranges Modul Phytosterol-Vorstufe [7, 9] β-Carotin CrtYI (Pantoea ananatis) grünes Modul Lebensmittelfarbstoff, Vitamin A-Vorstufe [10] Referenz [8] [8] ˚ Abb. 1: Modulares Konzept zur Implementierung und Verbesserung der Terpenoidproduktion in Rhodobacter. Die jeweiligen Module sind farblich markiert und umfassen die folgenden Strategien: Gelbes Modul: Optimierung der Expression von Terpenoid-Biosynthesegenen. RBS: Ribosomenbindestelle. Rotes Modul: Metabolic Engineering der Isoprenbiosynthese. Dieser Optimierungsschritt kann die heterologe Expression der MVA-Biosynthesegene einschließen. MEP: 2-C-Methylerythritol 4-phosphat; MVA: Mevalonat. Grünes Modul: Optimierung der Prenylphosphat-Synthese. Die Prenylphosphat-Verbindungen GPP, FPP sowie GGPP sind die direkten Terpenoidvorstufen, die durch geeignete Terpensynthasen (blaues Modul) zu den gewünschten Zielverbindungen umgesetzt werden. Oranges Modul: Optimierung des Zusammenspiels der einzelnen Engineeri (...truncated)