Bakterielle Cellulose — ein Netzwerk gestaltet von drei Cellulosesynthasen

218 B I O T ECH NOLOGIE Cellulosesynthese Bakterielle Cellulose – ein Netzwerk gestaltet von drei Cellulosesynthasen MARTIN BIMMER, WOLFGANG LIEBL, ARMIN EHRENREICH LEHRSTUHL FÜR MIKROBIOLOGIE, TU MÜNCHEN, FREISING Besides plants also some bacterial genera are able to synthesize cellulose in remarkably high quantities. Bacterial cellulose from the acetic acid bacterium Komagataeibacter hansenii has a big advantage supporting its use as multifunctional and sustainable material – it is free of non-cellulosic components, unlike cellulose of plant origin. Based on marker-free in frame deletions, we propose a model where cellulose fibers released by the main cellulose synthase (BcsAB1) are modified by two additional cellulose synthases. DOI: 10.1007/s12268-023-1908-9 © Die Autoren 2023 ó Cellulose ist das am häufigsten vorkommende natürliche Biopolymer auf unserem Planeten. Als Hauptbestandteil pflanzlicher Zellwände stellt sie rund 40 Prozent der weltweiten Gesamtbiomasse [1]. Was meist weniger bekannt ist: Auch einige Bakteriengattungen sind in der Lage, Cellulose in vergleichsweise großen Mengen herzustellen. Dabei greifen diese auf dieselbe Enzymatik zurück, wie es höhere Pflanzen tun [2]. Essigsäurebakterien, insbesondere Vertreter der Gattung Komagataeibacter, sind besonders prominente Produzenten bakterieller Cellulose (BC). Diese macht den Hauptbestandteil der Essigmutter aus, also jenes massiven Biofilms, der sich auf der Oberfläche von stehenden alkoholischen Getränken – wie Wein – bildet und in dem Essigsäurebakterien Alkohol in Gegenwart von Sauerstoff zu Essigsäure oxidieren. Die Homologie des bakteriellen Cellulosesynthase(CS)-Komplexes zum pfl anzlichen System macht die Cellulosesynthese in Komagataeibacter zu einem hervorragenden Modellsystem [3]. Als Modellorganismen haben sich hier zwei K. hanseniiStämme etabliert, wobei sich der Stamm ATCC 53582 durch eine um ein Vielfaches höhere Produktionsmenge und -geschwindigkeit im Vergleich zum Stamm ATCC 23769 auszeichnet. Die hohe Reinheit von BC sowie deren hohe Biokompatibilität sind Gründe, warum es für BC vielfältige biotechnologische Anwendungsmöglichkeiten gibt. Die genetische Grundlage für die Synthese von BC besteht in den erwähnten Stämmen aus drei Gruppen von benachbarten Genen, die jeweils mindestens eine CS (bcsAB) und ein Kanalprotein (bcsC) codieren und jeweils wahrscheinlich Operons sind (Abb. 1B). Diese unterscheiden sich durch die Anzahl an zusätzlich codierten akzessorischen Proteinen [4]. Ein von unserer Arbeitsgruppe etabliertes Deletionssystem, das auf der Gegenselektion durch eine Cytosin-Desaminase in Anwesenheit von 5-Fluorocytosin beruht, wurde zur Konstruktion der Mutanten genutzt [5]. Dies erlaubte es erstmals, chromosomale markerfreie in-frame-Deletionen in Cellulose-produzierenden Essigsäurebakterien zu konstruieren [6]. Anhand der Phänotypen der erzeugten Einzel- und Doppelmutanten konnten wir damit beginnen, die spezifische physiologische Rolle jeder einzelnen der drei CS zu bestimmen, deren Gene in den drei putativen Operons unterschiedlicher Komplexität liegen [7]. Phänotypische Unterschiede von K. hansenii ATCC 23769 und ATCC 53582 Die Charakterisierung der Celluloseproduktion wurde in unbewegten, statischen Kulturen auf Komplexmedium mit Glucose durch- geführt. Obwohl beide K. hansenii-Stämme sich in der Struktur der drei CS-Operons ähneln, unterscheiden sie sich deutlich in der Menge und Geschwindigkeit der Celluloseproduktion. Während der Stamm K. hansenii ATCC 23769 für 21 Tage inkubiert wurde, bis sich ein massiver Biofilm bildete, reichten für den Hoch-Cellulose-Produktionsstamm K. hansenii ATCC 53582 bereits sechs Tage aus. Beitrag der einzelnen Cellulosesynthasen Die konstruierten markerfreien in-frameDeletionsstämme, die jeweils nur eine der drei CS bildeten (BcsAB1, BcsAB2 oder BcsAB3), verdeutlichten die bereits in den Wildtypen beobachteten phänotypischen Unterschiede (Abb. 1A). Beiden K. hanseniiStämmen ist gemein, dass die Bildung der Haupt-CS BcsAB1 hinreichend und notwendig ist, um einen geschlossenen, festen und stabilen Biofilm zu bilden, der die gesamte Oberfläche des Kulturmediums bedeckt. Der Hochproduzent ATCC 53582 überragt auch bei alleiniger Expression der Haupt-CS den anderen Stamm ATCC 23769 deutlich. Unterschiedliche Beobachtungen wurden jedoch für die Einzelexpressionstämme der zusätzlichen CS gemacht. Im Stamm ATCC 23769 wurde bei alleiniger Expression von bcsAB2 bzw. bcsAB3 jeweils ein fragmentiertes, dünnes Pellikel gebildet. Dagegen war bei Expression nur von bcsAB2 oder bcsAB3 im Hochproduzenten, ATCC 53582, an der Oberfläche der Kultur gar kein freigesetztes extrazelluläres Polymer zu erkennen. Effekte der drei Cellulosesynthasen auf die räumliche Struktur des Netzwerks Der mikrostrukturelle Aufbau des Cellulosenetzwerks wurde im Rasterelektronenmikroskop aufgeklärt. Die Aufnahmen beider K. hansenii-Stämme zeigten die typische Struktur von BC (Abb. 1A): Ein stark quervernetztes Netzwerk aus Cellulosefasern. K. hansenii ATCC 23769 synthetisiert insgesamt eine geringere Menge Cellulose, aber, BIOspektrum | 02.23 | 29. Jahrgang 219 A B wie wir aus den Doppel-Deletionsstämmen wussten, bilden die zusätzlichen CS BcsAB2 und BcsAB3 hier mehr Polymer als im Hochproduzenten. Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen zeigten neben den von BcsAB1 gebildeten Cellulosemikrofibrillen weitere extrazelluläre polymere Substanzen (EPS). Diese zusätzlichen EPS ließen sich anhand der Deletionsmutanten jeweils der Expression von bcsAB2 bzw. bcsAB3 zuordnen. Bei diesen Substanzen handelt es sich nach dem elektronenmikroskopischen Bild um scheinbar amorphe und bisher noch nicht näher charakterisierte Formen der Cellulose. Die von BcsAB2 gebildete Form findet sich dabei insbesondere in den Zwischenräumen des Fasernetzwerks. Die von BcsAB3 gebildete Substanz wird in nochmals deutlich geringerer Menge gebildet und umschließt die Einzelzellen. Deutlich anders verhielt es BIOspektrum | 02.23 | 29. Jahrgang ¯ Abb. 1: Phänotypen und Genetik der bakteriellen Cellulose-Synthese bei K. hansenii. A, Phänotyp Komagataeibacter hansenii-Hochproduzent ATCC 53582 (rechts) bzw. ATCC 23769 (links) nach statischer Kultivierung (oben) und im elektronenmikroskopischen Bild (unten). Wildtyp bzw. Stämme nach Deletion der zusätzlichen CS-Gene. B, Aufbau der drei (putativen) CS-Operons exemplarisch für ATCC 23769. C, mögliches Schema Faserzusammenlagerung: Mikrofibrillen (grau), Produkt BcsAB2 (blau) bzw. BcsAB3 (grün). C sich für den Hoch-Cellulose-Produktionsstamm K. hansenii ATCC 53582: In der elektronenmikroskopischen Aufnahme waren lediglich die verknüpften Cellulosefasern zu erkennen. Jedoch nahm sowohl deren Abstand zueinander als auch die Dicke nach einer markerfreien in-frame-Deletion von bcsAB2 bzw. bcsAB3 signifikant ab. Ein separates Polymer, das der Expression dieser Gene zugerechnet werden könnte, konnte dagegen nicht erkannt werden. Zur Unterscheidung dieser neu beschriebenen, (...truncated)