Live Cell Imaging funktionaler Parameter von Kardiomyozyten

358 W I S S EN S CH AFT · S PECIA L : ZELLBI OLOGI E & CE LL IMAGING Molekulare Medizin Live Cell Imaging funktionaler Parameter von Kardiomyozyten SYMEON PAPADOPOULOS, AGAPIOS SACHINIDIS ZENTRUM FÜR PHYSIOLOGIE, UNIVERSITÄT ZU KÖLN Because of the advantages of dynamic, non-invasive live cell imaging techniques (LCIT) over static visualisation methods, the former are increasingly applied in various disciplines such as biomedicine, cell biology, pharmacology, and developmental biology, to obtain more reliable results than with fixed cells. We prove and discuss the advantages of LCIT via its application in real-time visualization of sarcomeres, Ca2+ changes and ROS in cardiomyocytes from human induced pluripotent stem cells. DOI: 10.1007/s12268-023-1953-4 © Die Autoren 2023 ó Humane induzierte pluripotente Stammzellen (hiPSCs) können zur Erzeugung somatischer Zellen – wie z. B. Kardiomyozyten (CMs) oder Hepatozyten – differenziert werden. Diese können mittels in vitro-Testsystemen zum Nachweis nachteiliger Effekte von z. B. Medikamenten und anderen Umweltstressfaktoren eingesetzt werden [1, 2]. Die klassischen Verfahren (z. B. immunhistochemische Methoden) zum Nachweis pathologischer struktureller Veränderungen des Cytoskeletts in CMs sind hierbei oft ineffizient, da sie statische Momentaufnahmen von fixierten Zellen erlauben. Für eine kostengünstigere und weniger zeitaufwändigere Visualisierung und Quantifizierung dynamischer Vorgänge funktioneller Parameter, wie z. B. der muskulären Einzelfaserkontraktion und der intrazellulären freien Ca2+-Konzentration ([Ca2+]i), sind Live-Cell-Imaging(LCI)Verfahren erforderlich. Wir haben drei transgene hiPSC-Zelllinien erzeugt [2, 3], die jeweils zu CMs differenziert wurden [2, 3]. Die CMs erlauben die Visualisierung von Sarkomeren, der [Ca2+]i bzw. Veränderungen in der Produktion von reactive oxygen species (ROS) in den Mitochondrien, in Echtzeit (Abb. 1). Live Cell Imaging von Sarkomeren in hiPSC-CMs Die clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)-Technologie ermöglicht das Einbringen gezielter genetischer Veränderungen in hiPSCs. Dies ermöglicht die stabile Expression entsprechend veränderter Proteine, z. B. die Expression von enhanced green fluorescent protein(eGFP)gekoppelten Reporter-Proteinen. Dadurch eröffnet die CRISPR-Cas9-Technologie zahlreiche Möglichkeiten für die Live-Cell-Visualisierung und funktionelle Charakterisie- ¯ Abb. 1: Allgemeines Schema zur Herstellung von humanen transgenen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) und der abgeleiteten Kardiomyozyten (CMs). A, obere Abbildung: Beginn der Erhöhung der intrazellulären Ca2+Konzentration ([Ca2+])i; untere Abbildung: Maximum der [Ca2+]i in von GECI-eGFP+-hiPSCs (genetically-encoded-Ca2+-indicator-enhancedgrün-fluoreszierendes-Protein-hiPSCs)-abgeleiteten CMs (GECI-eGFP+-hiPSC-CMs). Das intrazelluläre Ca2+ wird sichtbar als grüne Farbe. B, ACTN2 (α-cardiac actinin) ist angereichert in den Z-Scheiben (grüne Farbe) der Sarkomere von ACTN2-copepod(ACTN2-cop)-GFP+-hiPSCs abgeleiteten CMs (ACTN2-copGFP+-CMs). C, Visualisierung mitochondrialer ROS in unbehandelten (grüne Farbe) und mit Doxorubicin behandelten (= Positivkontrolle; rote Farbe) DyRed1-ES+-CMs. BIOspektrum | 04.23 | 29. Jahrgang 359 rung zellulärer Proteine mittels Fluoreszenzmikroskopie. In dem hier präsentierten Beispiel haben wir mittels CRISPR/Cas9 das Stopcodon des in hiPSCs transkriptionell inaktiven, herzspezifischen α-Aktinin-Gens (ACTN2) entfernt und es durch copGFP ersetzt. Die so gewonnenen ACTN2-copGFP+hiPSCs können durch ein spezielles Protokoll zu ACTN2-copGFP+-CMs differenziert werden. Durch das so in Z-Scheiben eingebaute ACTN2 wird eine Visualisierung von Sarkomeren ermöglicht [4]. Wir haben die Anwendbarkeit unserer Plattform mittels Verwendung von Isoprenalin als klassischem Adrenorezeptor-Agonisten, mittels des L-Typ-Kalziumkanal-Agonistens Bay-K8864, des L-Typ-Kalziumkanal-Blockers Nifedipin sowie des muskarinischen Agonistens Carbachol validiert [3]. Der Hauptvorteil unserer Linie gegenüber anderen Zellsystemen besteht darin, dass wir das native ACTN2Gen editiert haben, indem wir sein Stopcodon entfernt und es durch die copGFPSequenz ersetzt haben [4, 2, 3]. Live Cell Imaging von transienten Veränderungen der intrazellulären Ca2+-Konzentration in hiPSC-CMs Für die Live-Cell-Bildgebung transienter Veränderungen von [Ca2+]i in CMs haben wir transgene GECI-eGFP+-hiPSCs mit genetisch codierten Ca2+-Indikatoren (GECI) hergestellt. Diese können zu GECI-eGFP+-CMs differenziert werden. Die Anwendung genetisch codierter Biosensoren (GKB) auf der Basis einzelner fluoreszierender Proteine basiert auf der allosterischen Modulation eines einzelnen fluoreszierenden Proteins [5]. Das Prinzip des Ca2+/GCaMP-Biosensors liegt darin, dass in den GECI-eGFP+-CMs Ca2+ an die Calmodulin-Komponente bindet, die mit dem eGFP und dem Calmodulin-bindenden Peptid M13 fusioniert ist. Die Bindung des Ca2+ führt zur einer Konformationsänderung von Calmodulin [5]. Dadurch kommt es zu einer stärkeren Bindung von CaM zum M13-Peptid. Dies führt zu einer beschleunigten De-Protonierung des eGFP-Chromophors, wodurch eine Verstärkung des Fluoreszenz- signals von eGFP stattfindet. GKB für die Ca2+-Bildgebung besitzen mehrere Vorteile, verglichen mit chemisch synthetischen LCIFarbstoffen wie Fluo-4. Die Beladung von Zellen, z. B. mit Fluo-4, ist invasiv, nicht kontrollierbar und wird mit Off-Target-Effekten begleitet [3]). Die mit GKB gewonnenen Befunde sind robust und reproduzierbar [5]. Abbildung 2 zeigt die Fluktuationen der [Ca2+]i von GECI-CMs, welche 48 Stunden einer simulierten Mikrogravitation (SMGCMs) [2] ausgesetzt waren. Da ein großer (ΔF/Δt)max-Wert mit einer erhöhten inotropen Wirkung korreliert, folgern wir, dass der SMG-Stress einen negativ inotropen Effekt auf die Kontraktilität der CMs ausübt. Visualisierung der Mitochondrialen ROS-Produktion in hiPSC-CMs Zur Visualisierung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) in Mitochondrien in Echtzeit haben wir eine transgene hiPSC-Linie (IMR90) erzeugt, welche die Expression des genetisch codierten Sensorproteins Mito- 360 W I S S EN S CH AFT · S PECIA L : ZELLBI OLOGI E & CE LL IMAGING A ¯ Abb. 2: Stresseffekte einer simulierten Mikrogravitation (SMG) auf A, die [Ca2+]i-Fluktuationen während der Kontraktion von KontrollGECI-eGFP+-CMs (c-CMs) und B, GECIeGFP+-CMs, die 48 Stunden einer SMG ausgesetzt waren (SMG-CMs) (Olympus FluoView1000; Exit./ Emmis.: 488/ 510 nm). Die Videoaufnahmen der Fluktuationen wurden mit dem Video-Analyse Softwaretool (VA1.9) analysiert. C, maximale Steilheit der Fluoreszenzveränderung durch die zeitliche Veränderung (ΔF/ΔT)max (Mittelwert ± SEM, n = 6, * p < 0,05). D, timeto-peak (TTP: zeitliches Intervall, bis das Fluoreszenzmaximum erreicht ist). B C Timer in einer Tetracyclin (Tet)-induzierbaren Weise (Tet-on) ermöglicht. MitoTimer codiert für das DyRed1-E5-Protein (eine mutierte Form des DsRed-Protein (...truncated)