Molekulare Schnappschüsse der Phageninfektion

257 Proteomics und Transcriptomics von Viren Molekulare Schnappschüsse der Phageninfektion MAIK WOLFRAM-SCHAUERTE, NADIIA POZHYDAIEVA, KATHARINA HÖFER MAX-PLANCK-INSTITUT FÜR TERRESTRISCHE MIKROBIOLOGIE, MARBURG Today, the clinical potential of antibiotics is almost exhausted, which has led to a renaissance of phage research and phage therapy. To maximize phage therapy efficiency, we need an in-depth understanding of the molecular mechanisms by which phages fight their hosts. Omics technologies can provide valuable insights in the molecular processes of infection. We applied time-resolved proteomics and transcriptomics to characterize the T4 phage infection of Escherichia coli on the molecular level. DOI: 10.1007/s12268-023-1923-x © Die Autorinnen und Autoren 2023 ó Bakteriophagen (Phagen) sind Prokaryoten-spezifische Viren, die in zahlreichen Ökosystemen vorkommen und den größten Anteil der Biomasse auf der Erde ausmachen. Ihre Entdeckung durch Felix d‘Herelle in den 1910er-Jahren und die darauffolgende Forschung an Bakteriophagen hat das Verständnis für die molekularen Grundlagen des Lebens immens vorangetrieben [1]. Grundlegende Entdeckungen, wie die Identifizierung von DNA als zelluläres Erbgut, die Entdeckung des genetischen Triplet-Codes, mRNA, und viele molekularbiologische Werkzeuge, sind die Errungenschaften von Forschung an Phagen. Die Fähigkeit von Phagen, Bakterien zu töten, war besonders klinisch interessant und wurde bereits 1919 in der ersten Phagentherapie bakteriell infizierter Patienten eingesetzt [2]. Jedoch leitete die zufällige Entdeckung von Penicillin durch Alexander Fleming [3] die Ära der Antibiotika ein, die schnell gegen viele bakterielle Spezies wirkten. Dagegen gerieten die Phagen u. a. aufgrund ihres komplexeren Wirkmechanismus zunehmend in den Hintergrund. Heutzutage ist das therapeutische Potenzial bekannter Antibiotika fast ausgeschöpft und die Verbreitung multiresistenter Bakterien stellt eine große Herausforderung dar. Vor diesem Hintergrund können Phagen im Rahmen einer Phagentherapie von besonderem Nutzen sein, da sich die Mechanismen, mit denen Phagen Bakterien töten, von denen BIOspektrum | 03.23 | 29. Jahrgang der Antibiotika komplett unterscheiden. Diese Lage führte in den vergangenen Jahren zu einer Renaissance der Phagenforschung [4]. Um Phagen als effiziente Alternative zu Antibiotika einsetzen zu können, ist ein genaues Verständnis der Mechanismen notwendig, mit denen Phagen ihre bakteriellen Wirte gezielt und hochspezifisch töten. Dazu ist jedoch bis heute wenig bis gar nichts bekannt. Der T4-Phage infiziert das Bakterium Escherichia coli Am besten sind die molekularen Mechanismen an Modellphagen charakterisiert worden, wie z. B. am Bakteriophagen T4 (T4-Phage). Der T4-Phage infiziert spezifisch das Bakterium Escherichia coli [5]. Das T4-Phagen-Genom umfasst 169-kb-lange doppelsträngige DNA und codiert für 288 Gene. Allerdings sind nur 55 Prozent der dadurch codierten Proteine funktional beschrieben. Die T4-Phagen-Infektion ist ein zeitlich stark regulierter Prozess, der bereits innerhalb von 20 bis 30 Minuten zur Lyse des infizierten Bakteriums führt (Abb. 1). Insgesamt teilt man die T4-Phagen-Infektion in drei Phasen ein, die sich durch die Expression spezifischer Phagen-Gene auszeichnen: frühe, mittlere und späte Phase. Das Andocken des Phagen an den Wirt und die Injektion seines Genoms in die Zelle, zusammen mit ˚ Abb. 1: Schematischer Ablauf der T4-Phagen-Infektion von Escherichia coli. Die PhagenInfektion beginnt mit dem Andocken des Phagen an die Wirtszelle (1) und Injektion seiner DNA (2). Dann beginnt die Expression von Phagen-Genen (3). Sobald die strukturellen Proteine des T4-Phagen synthetisiert sind, beginnen sich neue Phagen zu bilden (4), die schließlich durch Lyse der Wirtszelle freigesetzt werden (5). 258 W I S S EN S CH AFT · S PECIA L : PROT E OMICS & CH ROMATOGR AP H I E ¯ Abb. 2: Dual-Transcriptomics und Proteomics-Ansatz zur zeitaufgelösten Charakterisierung der Genexpression während der T4-Phagen-Infektion. Die Gesamtheit der Transkripte und der Proteine von Escherichia coli während der T4-Phagen-Infektion wird zu unterschiedlichen Zeitpunkten der Infektion isoliert und mittels Transcriptomics und Proteomics analysiert. einigen Proteineffektoren, leiten die frühe Infektionsphase ein. „Frühe“ T4-PhagenGene werden exprimiert, die vor allem dazu dienen, den Wirt auf optimale Bedingungen für die Phagenproduktion umzuprogrammieren. Für den T4-Phagen bedeutet dies vor allem die Übernahme des Transkriptionsund Translationsapparats der Wirtszelle, da eine Phagen-eigene Maschinerie zur Proteinbiosynthese fehlt. Darauf folgt die Expression von „mittleren“ Genen, die u. a. zur Replikation des Phagen-Genoms und dem Übergang in die folgende „späte“ Infektionsphase beitragen. In der späten Phase werden vor allem diejenigen Gene exprimiert, die für strukturelle Proteine codieren und für die Entstehung neuer Phagen notwendig sind. Schließlich werden die neuen Phagen durch Lyse der Wirtszelle in die Umgebung freigesetzt. Unser heutiges Verständnis der T4-Phagen-Infektion basiert vorwiegend auf einzelnen, gezielten molekularbiologischen und biochemischen Studien [5]. Wenige Studien zielten bisher auf eine umfassendere Charakterisierung der T4-Phagen-Infektion ab. Dies gilt nicht nur für die Mechanismen, die die T4-Phagen-Genexpression auf Transkriptions- und Translationsebene kontrollieren, sondern auch für die Wirtsgenexpression während der Infektion. Wie also kann ein detaillierteres Verständnis dieser Ereignisse während der Phagen-Infektion erreicht werden? Hochdurchsatzcharakterisierung von Biomolekülen mittels OmicsTechnologien Die Entwicklung der Omics-Methoden im letzten Jahrzehnt brachte einen rapiden Anstieg im Detailverständnis komplexer biologischer Prozesse. Generell zielen OmicsTechnologien auf die Charakterisierung und Quantifizierung der Gesamtheit biologischer Moleküle ab, wie z. B. Genen (=Genomics), Proteinen (=Proteomics), Metaboliten (=Metabolomics) oder Transkripten (=Transcrip tomics). Während manche Bestandteile einer Zelle sich im Zeitverlauf eher statisch verhalten (z. B. Genome), ist die Abundanz anderer Moleküle in der Zelle, wie z. B. RNA oder Proteine, in Abhängigkeit von verschiedenen Einflüssen höchst dynamisch. Um diese Dynamiken ganzheitlich nachvollziehen zu können, sind hochsensitive Methoden erforderlich. Während zu Beginn der Proteomics-Ära der 1980er-Jahre die Gesamtheit der Proteine noch über zweidimensionale (2D) Gelelektrophorese analysiert wurde, ermöglichte die rasante Entwicklung von Massenspektrometrie-basierten Methoden seit den 2000erJahren auch eine Analyse komplexer Proteinmischungen. Dabei können einzelne Proteine mit hoher Sicherheit identifiziert und quantifiziert werden. Auch auf dem Gebiet Transcriptomics führte der methodische Fortschritt zu einem großen Durchbruch. Für die Analyse spezifischer Transkripte verwendete man ursprünglich Northern Blots und reverse Trans (...truncated)