Molecular Pharming–Produktion von Biopharmazeutika in Pflanzen

342 BI O T ECH NOLOGIE Pflanzenbiotechnologie Molecular Pharming – Produktion von Biopharmazeutika in Pflanzen PAUL ALEXANDER NIEDERAU, RALF RESKI PFLANZENBIOTECHNOLOGIE, UNIVERSITÄT FREIBURG The moss Physcomitrella is a promising production platform for green biopharmaceuticals. To further increase production yields of this platform, we identified terminator sequences to be used in future applications. In addition, we investigated which attributes make a terminator a good choice for biomanufacturing. Overall, our results improve plantbased biotechnology platforms and further our understanding of how terminators influence gene expression in plants in general. DOI: 10.1007/s12268-024-2174-1 © Die Autoren 2024 ó Der Markt für die Produktion von Biopharmazeutika hat ein prognostiziertes Potenzial von 3 Billionen US-Dollar in den Jahren 2030–2040 [1]. Darüber hinaus hat die COVID-19-Pandemie die Notwendigkeit für innovative und vielseitige Forschung im Bereich der Biotechnologie vor Augen geführt. Während der Großteil der Produktion in Mikroben oder Säugetierzellen erfolgt, A sind Pflanzen eine attraktive Alternative für die Produktion von eukaryotischen Proteinen [2]. Pflanzenbasierte Produktionssysteme operieren bei niedrigen Kosten, besitzen hohe Skalierbarkeit und sind frei von für den Menschen gefährlichen Pathogenen und Endotoxinen [3]. Ein populäres Pflanzensystem ist das Laubmoos Physcomitrella (Physcomi- B trium patens). Die Produktion in Physcomitrella findet in dem haploiden Entwicklungsstadium, dem Protonema, statt, das durch sein fädiges Wachstum gekennzeichnet ist (Abb. 1A). Der einfache Chromosomensatz sowie die hohe Rate für homologe Rekombination erlauben das präzise Ausschalten und Einbringen von Genen [4]. Dies erleichtert die Veränderung der pflanzenspezifischen Glykosylierung von rekombinanten Proteinen zu einer humanspezifischen Glykosylierung [5]. Diese Anpassung der posttranslationalen Modifikationen von Proteinen in Physcomitrella ist essenziell für die Effizienz und Wirksamkeit von in Pflanzen produzierter Biopharmazeutika. Das Protonema wird in Photobioreaktoren kultiviert (Abb. 1B). Diese funktionieren ähnlich wie bei Mikroben oder Säugetierzellen, jedoch besteht die Energiequelle aus Licht, das über Photosynthese zu Zuckern umgewandelt wird. Den Moosbioreaktoren werden keine Antibiotika oder tierischen Produkte zugefügt, sodass die so produzierten Pharmazeutika als vegan angesehen werden können, selbst wenn es sich um Proteine des Menschen handelt. Die Kultivierung von Physcomitrella in Photobioreaktoren ist konform mit den Vorschriften der Guten Herstellungspraxis (GMP) und entspricht damit den gesetzlichen Standards für die Produktion von Medikamenten. Das erste im Moos hergestellte Protein wurde von den Behörden zur Testung an Menschen zugelassen und hat in einer klinischen Studie bereits sehr erfolgreich die erste klinische Phase absolviert [6]. Der Terminator – ein essenzielles Element der Proteinbiosynthese ˚ Abb. 1: Das Laubmoos Physcomitrella. A, Die Protonemazellen des Mooses Physcomitrella wachsen als fädiges Geflecht und weisen einen haploiden Chromosomensatz auf. B, Die Mooszellen werden in 5-L-Photobioreaktoren kultiviert. Das LED-Licht und CO2 werden über Photosynthese in Zucker umgewandelt und dienen dem Moos als Energiequelle. Die Proteinbiosynthese beschreibt die Synthese von Proteinen und besteht aus zwei Schritten. Während der Transkription wird die DNA, die für ein bestimmtes Protein codiert, abgelesen und eine Kopie erstellt, die Boten-RNA (mRNA). In der Translation wird der Code der mRNA übersetzt und das entsprechende Protein synthetisiert. Diesen Prozess macht man sich in der Biotechnologie zunutze indem man Zellen, z. B. Bakterien, Hefen oder auch Pflanzenzellen, nutzt, BIOspektrum | 03.24 | 30. Jahrgang 343 um Proteine für verschiedenste Anwendungen zu produzieren. Dieser Prozess ist komplex und wird von einer Reihe unterschiedlicher Faktoren beeinflusst. Diese Faktoren zu kennen und zu verstehen, ermöglicht uns, diesen Prozess effizienter zu gestalten und vielfältige Produkte herzustellen [7]. Terminatoren sind ein wichtiges Element zur Steuerung der Proteinbiosynthese und folgen auf die Protein-codierende Sequenz eines Gens [8]. Während der Transkription geben sie das Ende des Ableseprozesses vor und leiten die Spaltung der mRNA ein. Polyadenylierungssignale im Terminator leiten das Anfügen von >20 Adenin-Basen an die Schnittstelle ein, die Polyadenylierung, und stabilisieren die entstandene mRNA [9]. Bei der anschließenden Translation rekrutieren der Poly-A-Schwanz und andere genetische Elemente die notwendigen Enzyme für das Ablesen der mRNA und die Synthese des Proteins. Neben den Promotoren – der funktionalen Einheit eines Gens, das die Transkription initiiert – gehören Terminatoren zu grundlegenden genetischen Elementen der Genexpression. Trotzdem wurde ihr Potenzial zur Verbesserung der Produktion rekombinanter Proteine lange vernachlässigt. Multifaktorielle Analyse von Terminatoren in Physcomitrella In unserer aktuellen Studie [10] haben wir 14 neue Terminatoren aus den über 53.000 Kandidaten des Moosgenoms selektiert. Die Auswahl erfolgte anhand verschiedener Kriterien, z. B. der Abundanz der entsprechenden mRNA, der Funktion des codierten Proteins und der Länge des Terminators. Im Anschluss testeten wir den Effekt der ausgewählten Kandidaten auf die Proteinbiosynthese in Physcomitrella. Dazu kombinierten wir die Terminatoren mit einem Luciferase-Gen und schleusten die Luciferase-Terminatorsequenzen in Mooszellen ein. Die translatierten Luciferaseproteine geben ein starkes Lichtsignal von sich, die Biolumineszenz, das wir auslesen können und das uns ermöglicht, Rückschlüsse auf den verwendeten Terminator zu ziehen. Der Vergleich mit viel genutzten Terminatoren ergab, dass neun der 14 Terminatoren die gleichen Expressionsstärken erzielten und somit interessant für die weitere biotechnologische Anwendung sind. Zur Validierung wurden die Terminatoren mit zwei anderen Promotoren kombiniert und abermals getestet. Das Ergebnis bestätigte zwar die positiven EffekBIOspektrum | 03.24 | 30. Jahrgang ˚ Abb. 2: Die Hauptkomponentenanalyse veranschaulicht komplexe Zusammenhänge mehrerer Faktoren. Spitze Winkel zwischen zwei Vektoren deuten auf einen starken Zusammenhang der Faktoren hin. Winkel von ca. 90° deuten auf einen fehlenden Zusammenhang hing. Unsere Daten zeigen, dass die Anzahl der Poly-A-Signale einen starken Effekt auf die Höhe der gemessenen Luciferase-Signale hat. te der ausgewählten Terminatoren, zeigte jedoch auch, dass Promotoren in Physcomitrella wesentlich stärkere Modulatoren der Proteinbiosynthese sind als Terminatoren. In einem weiteren Experiment testeten wir Doppelterminatoren bestehend aus zwei gleichen oder unterschiedlichen Einzelterminatoren. Das Ergebnis zeigt, dass Doppelterminatoren das Potenzial haben, die Produktausbeute weiter zu steigern. Obwohl die Mechanismen der Doppelterminatoren (...truncated)