Caractérisation et évolution des hémoglobines dans le cours du développement postembryonnaire chez la Poule

0 Section de Biologie generale et appliquee, Laboratoire associe au C.N.R.S., Faculte des Sciences de Lyon Un certain nombre de travaux ont dj montr l'existence, dans le cours du dveloppement embryonnaire et postembryonnaire de la Poule, de plusieurs hmoglobines se succdant dans le temps. Cependant une difficult considrable provient du dsaccord entre les auteurs au sujet des rsultats que donne le fractionnement des hmolysats. Chez la poule adulte, le nombre des fractions obtenues va de deux cinq selon les auteurs. Les hmoglobines de l'adulte servant de rfrence dans l'tude des hmoglobines de l'embryon et du poussin, l'inscurit de leur dfinition rend alatoire toute conclusion concernant les changements qui peuvent intervenir sur ce point au cours du dveloppement. Il nous a donc paru ncessaire de soumettre au recoupement d'un ensemble de techniques les fractions d'hmoglobine que l'on peut obtenir partir d'un hmolysat de poule et de poussin. L'ensemble de ces techniques nous a conduit admettre l'existence de quatre constituants dans les hmoglobines de poule adulte. Elles aboutissent galement une caractrisation d'hmoglobines propres au jeune poussin, apparemment distinctes des hmoglobines de l'embryon de 5 7 jours. - Prparation des hmolysats. Les animaux utiliss appartiennent la race Leghorn. Les adultes sont gs d'au moins 6 mois et les poussins de 1 4 jours. Les erythrocytes, fraichement collects par dcapitation, sont lavs trois fois avec une solution saline isotonique avant d'tre lyss par un mlange d'eau et de tolune (1/0,2). Dans certains cas, on a incorpor l'eau de lyse du mercaptothanol (concentration finale 4 mM). Toutes les oprations suivantes sont pratiques 4 C. Aprs 1 h de contact, le lysat est centrifug 30000# pendant 30 min. Les chromatographies et electrophoreses successives sont ensuite enchanes sans perte de temps, de telle faon que l'ensemble des oprations, depuis la rcolte du sang, ne dure pas plus de 4 jours. La conservation plus longue des hmolysats modifie en effet leurs proprits et provoque l'apparition de constituants artefactuels. Dans certains cas, afin de tester, parmi les causes possibles d'artefacts, celles rsultant d'une transformation de l'hmoglobine en composs dots d'tats d'oxydation diffrents, l'hmolysat a t trait par une solution de ferricyanure-cyanure de potassium (concentration 1 mM-0,5 mM par g d'Hb) afin d'obtenir une cyanmthmoglobine; les oprations ultrieures sont alors conduites en prsence de KCN (10 mg/1.). Fig. .1. Filtration d'un hmolysat de Poule sur Sephadex G 75. La fraction 1 renferme les protines autres que l'hmoglobine. La fraction 2 contient la totalit de l'hmoglobine. La fraction 3 comprend des composants de faible poids molculaire de nature non protique. Purification des hmolysats sur Sephadex. Une colonne de Sephadex G 75 ( 2 x 4 0 cm) est quilibre avec un tampon 0,35 M-NaCl-0,01 M-Tris ajust pH 7,0 par N-HC1. Elle est charge avec 150 mg de protines et lue un dbit horaire de 20 ml. La densit optique de l'luat est enregistre de faon continue 253 m/t par un Uvicord LKB (fig.l). Concentration et dialyse de la solution d'hmoglobine. Pour tre passes en electrophorese ou en Chromatographie, les solutions obtenues la sortie de la colonne de Sephadex (ou la sortie d'une colonne de Chromatographie) doivent tre concentres et dialyses contre un tampon adquat. Pour cela, elles sont filtres, sous aspiration par le vide, dans un sac de collodion (Membranfilterges, Gttingen), plac au contact du tampon choisi pour l'opration suivante. Chromatographie sur celluloses changeuses d'ions. On a utilis d'une part les CM- et DEAE-celluloses Serva (capacits respectives de 0,7 m-equiv/g et 0,8 mequiv/g), d'autre part les CM53 et DE52 microgranulaires Whatmann (capacit 1 m-equiv/g). Les celluloses Serva subissent, avant d'tre utilises, plusieurs lavages pratiqus selon la mthode de Peterson & Sober (1958). Elles sont ensuite quilibres contre le tampon de dpart de la chromatographic Seule la dernire tape est ncessaire pour les celluloses Whatmann. Les colonnes de CM-celluloses (35 x 0,6 cm) reoivent 21 mg d'hmoglobine et les colonnes de DE-celluloses (15 x0,6 cm) 15 mg. L'luant est un tampon Tris-HCl maintenu pH 6,9 pour les CM-celluloses et pH 8,6 pour les DE-celluloses; il est fourni un dbit constant de 18 ml/h. On a employ selon les cas une lution par paliers de concentration ou par un gradient linaire de concentration; les conditions exactes de l'lution seront dfinies plus loin. Electrophorse sur gel d'amidon. Elle est pratique selon la technique dj dcrite (Godet, 1967). Dans de nombreux cas, on a substitu au tampon acide borique 0,03 M ajust pH 8,6 par N-NaOH, qui exige en moyenne 3 h d'lectrophorse, un tampon Tris 0,03 M ajust pH 8,0 par l'acide borique cristallis. Dans ces conditions, une bonne sparation des hmoglobines est obtenue en une heure. Electrophorse sur gel de Polyacrylamide. Elle est conduite selon la technique dcrite antrieurement (Schren, Godet, Nigon & Blanchet, 1968). Dans quel ques cas, on a employ aussi la technique de Davis (1964). Pour luer les hmo globines ainsi spares, les boudins de Polyacrylamide sont dcoups, broys Tableau 1. Modes d*lution utiliss en Chromatographie sur CM- et DE-celluloses et sparations obtenues Paliers discontinus de concentration Tampon Tampon Gradient Hb du 2e Hb du 3e Hb linaire de lue palier lue palier lue concentration A2 A3 + A4 A3 Toutes les molarits indiques sont celles du Tris prsent dans le tampon. Celui-ci est ajust, par N-HCI, pH 6,9 pour les colonnes de CM-cellulose (35 x 0,6 cm) et pH 8,6 pour les colonnes de DE-cellulose (15 x 0,6 cm). Elution par paliers: la concentration indique pour le tampon de charge correspond celle du tampon avec lequel la colonne d'echangeurs est quilibre. On a indiqu pour chaque palier le type d'hmoglobine lue. Elution par gradient: chaque colonne d'echangeurs est quilibre avant la charge de l'hmolysat avec un tampon contenant 0,01 M de Tris. On a indiqu la succession des hmo globines lues par l'application d'un gradient linaire de concentration M/100 M/5. dans un potter en prsence de tampon Tris-acide borique (Tris 0,01 M, pH 8,0) et laisss 1 h au froid. Le surnageant est recueilli aprs centrifugation pendant 30 min 30000 #. 1. Les hmoglobines de Vadulte Chromatographie sur CM52 Whatmann avec lution par paliers discontinus de concentration. On obtient ainsi quatre constituants distincts que nous dnom merons Ax A4. Le tableau 1 et la figure 2 rsument les rsultats. L'utilisation Fig. 2. Chromatographie sur cellulose Whatmann CM52 d'un hmolysat de Poule. Elution par paliers discontinus de concentration. L'indication de molarit corre spond la concentration en Tris, le pH tant ajust 6,9 par N - H C I . La premire molarit est celle du tampon de charge. d ' h m o l y s a t s d a n s lesquels l ' o x y h m o g l o b i n e a t t r a n s f o r m e en c y a n mthmoglobine n'apporte aucune modification au diagramme de sparat (...truncated)