Technique d'extraction de 12 benzodiazépines dans le plasma. Résultats expérimentaux multicentriques

Annales de Toxicologie Analytique, vol. XVIII, n° 2, 2006 Technique d’extraction de 12 benzodiazépines dans le plasma. Résultats expérimentaux multicentriques Extraction procedure of 12 benzodiazepines from plasma. Results of a multicentric study Nicole JOURDIL(1)*, Bernard CAPOLAGHI(2), Michèle ARTUR(3), Raphaël DENOOZ(4), Nicole HOUDRET(5), Marie-France KERGUERIS(6), Denis LAMIABLE(7), Sabine COHEN(8), Mustapha MOULSMA(9), Nouredine SADEG(10), Alain TURCANT(11) (Groupe de travail “Toxicologie hospitalière” de la SFTA) (1) UF Pharmacologie-Département de Biologie et Pathologie de la Cellule, CHU Grenoble (2) Laboratoire de Biologie, CH Thionville (3) Laboratoire de Pharmacologie et Toxicologie, CHU Dijon (4) Laboratoire Toxi-Clinique, CHU Liège (5) Laboratoire de Biochimie, CHU Lille (6) Laboratoire de Pharmacologie-Toxicologie, CHU Nantes (7) Laboratoire de Pharmacologie-Toxicologie, CHU Reims (8) Laboratoire des Urgences Biochimiques et Toxicologiques, CHU Lyon-Sud (9) UF Pharmaco-Toxicologie et Analyses des éléments trace, CHU Lyon (10) Laboratoire Claude Bernard, CH Pontoise (11) Laboratoire de Pharmacologie, CHU Angers *Auteur à qui adresser la correspondance : Nicole JOURDIL, UF Pharmacologie-Département de Biologie et Pathologie de la Cellule, CHU de Grenoble, Hôpital Michallon, 38043 GRENOBLE Cedex 09 Tél : 04 76 76 54 92 - Fax : 04 76 76 89 38 - E-mail : (Reçu le 1er septembre 2005 ; accepté le 2 novembre 2005) 95 Article available at http://www.ata-journal.org or http://dx.doi.org/10.1051/ata:2006001 Annales de Toxicologie Analytique, vol. XVIII, n° 2, 2006 RÉSUMÉ SUMMARY Dans le cadre des différents thèmes de travail proposés aux membres de la commission de Toxicologie Clinique de la SFTA, une étude est réalisée sur l’identification et la quantification simultanée de 12 benzodiazépines dans le plasma. L’objectif est de tester la robustesse d’une technique d’extraction en l’imposant aux différents participants, les conditions chromatographiques de séparation et le mode de détection restant libres, fonctions de l’équipement de chaque laboratoire. L’étude a été réalisée sur une période de 2 mois et demi. Deux échantillons tests de plasmas surchargés avec 12 benzodiazépines à des concentrations thérapeutiques ou supra-thérapeutiques sont adressés à chaque centre d’investigation en vue de leur évaluation. La technique d’extraction utilise un mélange d’hexane / dichlorométhane en milieu tamponné (pH 9.2) et le loflazépate d’éthyle comme standard interne. Une méthode CLHP avec détecteur à barrette de diode est proposée à défaut par le laboratoire coordonnateur aux participants ne disposant pas de technique d’analyse. Sur les 11 participants, 10 utilisent une technique CLHP, un seul une technique CPG. Parmi les techniques CLHP, 2 d’entre elles associent un détecteur de masse, 7 un détecteur à barrette de diodes, 1 un détecteur UV. La technique CPG est associée à un détecteur de masse. L’analyse des résultats montre que la technique d’extraction proposée a été testée avec succès par 8/11 des participants : 4/11 laboratoires sans erreur et 4/11 laboratoires avec 1 ou 2 résultats exclus. Par contre, 3/11 laboratoires ont rencontré des difficultés majeures : un site par la survenue d’émulsions lors du traitement des échantillons tests (plasmas lyophilisés à reconstituer), un site par manque de temps et d’expérience, le troisième mettant en cause le choix du standard interne en technique CPG, le loflazépate d’éthyle n’ayant pas fait l’objet d’une étude préalable par cette technique. Within the framework of the various topics proposed to the SFTA members, a study was conducted on the simultaneous identification and quantitation of benzodiazepines in the plasma. The purpose was to test the reliability of a particular extraction procedure by imposing it to the various participants, the chromatographic conditions of separation and the detection modes remaining free, depending on the equipment available in each laboratory. The study extended over a period of two and a half months. Two plasma specimens containing overloads of twelve benzodiazepines at therapeutic and supra-therapeutic levels were supplied for evaluation to each investigation center. The extraction procedure used a mixture of hexan / dichloromethan with the use of a pH 9.2 buffer and ethyl loflazepate as internal standard. By default a HPLC method was proposed by the coordinating laboratory to the participants who didn’t have any methodology. Out of 11 participants, 10 used a HPLC method, only 1 used a GC method. Among the HPLC users, 2 used a mass spectrometry detector, 7 a photodiode array detector, 1 an UV detector. The GC method worked with a mass spectrometry detector. The analysis of the results showed that the extraction procedure had been successfully tested by 8/11 of the participants: 4/11 have returned results without any mistakes, 4/11 have returned 1 or 2 results that had to be excluded, 3/11 have encountered major difficulties: In one laboratory emulsions occurred while processing the specimens (lyophilised plasma to be reconstituted). One laboratory lacked time and experience. The last one questioned the internal standard choice in the GC method since ethyl loflazepate hadn’t been tested beforehand by this GC method. MOTS-CLÉS KEY-WORDS Benzodiazépines, procédure d’extraction, identification, quantification, CL-DAD, CL-SM, CL-SM/SM, CG-SM. Benzodiazepines, extraction procedure, identification, quantification, LC-DAD, LC-MS, LC-MS/MS, GC-MS. Introduction chaque participant. La technique d’extraction choisie, de type liquide / liquide, est volontairement simple et rapide de mise en œuvre. C’est le type de détecteur utilisé qui détermine ensuite le degré de sensibilité et de spécificité de l’analyse, limitant son application à une aide au diagnostic d’intoxication (détecteur UV ou à barrette de diodes), ou bien permettant son ouverture à de plus basses concentrations dans le cadre de la soumission chimique (détecteurs de masse). La coordination et l’exploitation des résultats de l’étude sont effectués par l’UF Pharmacologie-Département de Biologie et Pathologie de la Cellule du CHU de Grenoble. Dans le cadre des exercices menés par le groupe de travail “Toxicologie hospitalière” de la SFTA, le test de l’efficacité d’une technique d’extraction simple des benzodiazépines dans le sang, indépendamment de la technique d’analyse, est proposée à ses différents membres. Deux échantillons tests, contenant chacun plusieurs benzodiazépines à des concentrations thérapeutiques ou supra-thérapeutiques, sont transmis aux 11 laboratoires participants en vue de leur évaluation. L’objectif est de tester la robustesse d’une technique d’extraction des benzodiazépines en l’imposant à tous les participants. Il s’agit de tester la capacité d’une méthode analytique à rendre des résultats satisfaisants en présence de modifications de différentes conditions expérimentales ou environnementales (1), les conditions chroma (...truncated)