Detection of E. coli O157:H7 experimentally inoculated in raw milk samples by conventional method and multiplex PCR

Arq. Bras. Med. Vet. Zootec., v.60, n.5, p.1241-1249, 2008 Detecção de Escherichia coli O157:H7 inoculada experimentalmente em amostras de leite cru por método convencional e PCR multiplex [Detection of E. coli O157:H7 experimentally inoculated in raw milk samples by conventional method and multiplex PCR] P.M. Garcia1, E.F. Arcuri2*, M.A.V.P. Brito2, C.C. Lange2, J.R.F. Brito2, M.M.O.P. Cerqueira3 1 Aluno de pós-graduação - EV-UFMG – Belo Horizonte, MG 2 Embrapa Gado de Leite Rua Eugênio do Nascimento, 610 36038-330 – Juiz de Fora, MG 3 Escola de Veterinária - UFMG – Belo Horizonte, MG RESUMO Padronizou-se um método de reação em cadeia da polimerase (PCR) multiplex para detecção de Escherichia coli O157:H7 e avaliou-se a eficiência da PCR e de um método de cultivo convencional em placas na detecção desse patógeno experimentalmente adicionado em leite estéril e em leite cru com baixa contagem bacteriana total (média de 4,01 x 103 UFC/ml) e com alta contagem bacteriana (média de 2,10 x 106 UFC/ml). Foram padronizadas duas reações de PCR com o uso dos primers: "A" (RfbF; RfbR e FLICh7F/FLICh7R) e "B" (SLT-IF/SLTIR e SLT-IIF/SLT-IIR). A detecção de E. coli O157:H7 (1UFC/ml) a partir do leite estéril e do leite cru com baixa contaminação bacteriana foi possível quando se utilizou o método de contagem em placas e a PCR. A sensibilidade dos dois métodos foi menor quando se testou o leite cru com alta contaminação microbiana, sendo o método convencional mais sensível. Os resultados indicam que a presença de outros microrganismos, em alta quantidade no leite, dificulta a detecção de E. coli O157:H7 pelos métodos utilizados. Palavras-chave: PCR multiplex, E. coli O157:H7, antígeno O157, antígeno H7, genes para toxina tiposhiga ABSTRACT This experiment was carried out in order to evaluate the effect of the raw milk bacterial count on the efficiency of a multiplex polymerase chain reaction and a conventional plate count method for detection of Escherichia coli O157:H7. This pathogen was experimentally inoculated into sterile milk, raw milk with low bacterial count (count mean of 4.01 x 103 cfu/ml) and, raw milk with high bacterial count (mean 2.10 x 106 cfu/ml). Two protocols of PCR were standardized using primers "A" (Rfbf and Rfbr and FLICh7F/FLICh7R) and "B" (SLT-IF/SLTIR and SLT-IIF/SLT-IIR). Both conventional plate count and PCR methods were able to detect the presence of E. coli O157:H7 in either sterile milk or raw milk with low bacterial count initially inoculated with 1cfu of E. coli O157:H7 per ml. The sensibility of both methods for high-contaminated raw milk samples was lower, being the conventional approach more sensitive. These results indicate that high bacterial count in raw milk can affect E. coli O157:H7 detection. Keywords: PCR multiplex, E. coli O157:H7, O157 antigen, H7 antigen, shiga-like toxin genes Recebido em 10 de julho de 2007 Aceito em 3 de junho de 2008 E-mail: Garcia et al. INTRODUÇÃO Escherichia coli O157:H7 é um sorotipo de E. coli pertencente ao grupo EHEC (E. coli enterohemorrágicas). Esse grupo inclui estirpes que produzem fatores citotóxicos descritos como verotoxinas (VTs) ou Shiga-like toxinas (SLTs) (Doyle et al., 1997). Emergente nas últimas décadas, esse microrganismo é um importante patógeno causador de doença de transmissão alimentar (DTA) e, apesar de sua incidência relativamente baixa, constitui sério risco à saúde, sendo, algumas vezes, fatal, particularmente para crianças e para idosos (Foodborne..., 2002). Desde sua identificação em 1982, E. coli O157:H7 tem sido isolada em numerosos surtos envolvendo colite hemorrágica e síndrome hemolítica urêmica (Kuntz e Kuntz, 1999). Como agente de DTA, tem sido especialmente associada ao consumo de alimentos de origem animal como carnes, leites e produtos derivados (Mechie et al., 1997), uma vez que rebanhos bovinos leiteiros e de corte são os principais reservatórios para infecção humana por E. coli O157 (Griffin e Tauxe, 1991). A técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR) é um grande avanço no diagnóstico molecular de microrganismos patogênicos. PCR multiplex, técnica que detecta simultaneamente duas ou mais seqüências de DNA, tem sido utilizada na detecção de E. coli (Hu et al., 1999; Bottero et al., 2004; Macedo et al., 2007) e constitui uma alternativa importante na detecção desse patógeno em leite e derivados. Cerqueira et al. (1999) relataram alta incidência de STEC (Shiga-toxin producing E. coli) em bovinos sadios no estado do Rio de Janeiro (71% de portadores). Em gado leiteiro, a freqüência de isolamento foi de 82% e em gado de corte, 53%. Desses isolados, três (1,5%) foram identificados como E. coli O157:H7, sendo esse provavelmente o primeiro trabalho a relatar o isolamento desse sorotipo no Brasil. Ainda não se tem nenhum relato da ocorrência de E. coli O157:H7 em leite e derivados no Brasil, talvez pela dificuldade de detecção quando esse microrganismo está presente em número pequeno devido, por exemplo, à interferência da microbiota endógena do leite. Este trabalho teve como objetivos padronizar um método de PCR multiplex para detecção de E. coli O157:H7 e avaliar a eficiência dessa técnica, e de um método de cultivo convencional em placas, na detecção desse patógeno, inoculado experimentalmente em leite cru com baixa e alta contaminação microbiana. MATERIAL E MÉTODOS O trabalho foi desenvolvido nos Laboratórios de Microbiologia do Leite e de Genética Molecular da Embrapa Gado de Leite em Juiz de Fora, Minas Gerais. Para avaliar a sensibilidade e a especificidade do método de PCR multiplex foram utilizadas 30 estirpes de Escherichia coli e 14 pertencentes a outros gêneros bacterianos: Listeria monocytogenes (2), Listeria innocua, Listeria welshimeri, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Enterobacter cloaceae, Enterobacter sakazakii (2), Salmonella Typhi, Salmonella Typhimurium, Salmonella Dublin, Klebsiella pneumoniae e Shigella sonnei. Dentre as estirpes de E. coli, cinco eram E. coli O157:H7, uma E. coli O157 (IAL 0411), uma E. coli ATCC 11775, uma E. coli ATCC 25922, cinco E. coli (EPEC) e 17 E. coli isoladas de leite de vacas com mastite. Todas as estirpes de E. coli tiveram sua identificação confirmada por meio do Sistema API 20E1. Na extração de DNA microbiano utilizaram-se três métodos. Para cultura em meio líquido (caldo de enriquecimento), o DNA foi extraído pelo método fenol-clorofórmio (Jersek et al., 1996) e pelo método de lise térmica (Nunes et al., 1999). Para cultura em meio sólido, utilizouse o método de lise térmica diretamente da colônia (Hu et al., 1999). O DNA foi quantificado em espectrofotômetro2 e a concentração foi ajustada para 20ng/µl. Os primers testados para E. coli O157:H7 na reação de PCR foram propostos por Hu et al. (1999): RfbF 5’GTGTCCATTTATACGGACATCCATG-3’ e RfbR 5’CCTATAACGTCATGCCAATATTGCC-3’ 1 BioMérieux SA-Marcy-l’Etoile, França. GeneQuantpro, Healthcare GE Life Science– Upsala, Suécia. 2 1242 Arq. Bras. Med. Vet. (...truncated)