Massenspektrometrische Analyse von Phospholipiden aus Liposomen

167 Zellbiologische Methoden Massenspektrometrische Analyse von Phospholipiden aus Liposomen MELISSA FRICK, CARLA SCHMIDT INTERDISZIPLINÄRE WISSENSCHAFTLICHE EINRICHTUNG ZIK HALOMEM, CHARLES-TANFORD-PROTEINZENTRUM, UNIVERSITÄT HALLE-WITTENBERG Mass spectrometry-based lipidomics gained importance and nowadays allows the identification of complete lipidomes. Challenging are, however, the differing properties of the diverse lipid classes. Phospholipids are the main constituents of biological membranes and, in aqueous solutions, spontaneously form lipid bilayers. They are therefore often used to prepare membrane mimics. Here, we report on a recent strategy identifying and quantifying phospholipids from the lipid bilayer of liposomes. DOI: 10.1007/s12268-019-1017-y © Die Autoren 2019 ó Lipide sind Biomoleküle, die an einer Reihe von biologischen Prozessen, wie z. B. der Energiespeicherung oder Signalweiterleitung, beteiligt sind. Darüber hinaus sind sie wichtige Komponenten von Biomembranen. Glycerophospholipide (auch Phospholipide genannt) bestehen aus Glycerin, welches an zwei der drei Hydroxylgruppen mit zwei Fettsäuren verestert ist. An der dritten, endständigen Hydroxylgruppe ist eine Phosphatgruppe gebunden, die mit verschiedenen Alkoholen verestert sein kann. Entsprechend dieser Kopfgruppe werden Phospholipide in unterschiedliche Klassen eingeteilt. Beispiele sind Phosphatidylglycerol (PG), Phosphatidylcholin (PC), Phosphatidylethanolamin (PE), Phosphatidylserin (PS) und Phosphatidylinositol (PI) [1, 2]. Aufgrund ihrer amphipathischen Struktur bilden Phospholipide in wässrigen Lösungen Mizellen oder Lipiddoppelschichten (z. B. Liposomen) aus. So bilden sie auch das Grundgerüst von Biomembranen und bestimmen ihre physikochemischen Eigenschaften wie Dicke, Krümmung, Fluidität oder die Ausbildung von Mikrodomänen [3]. Die Identifizierung der Lipidbestandteile von Biomembranen ist somit essenziell, um ihren Aufbau und ihre Organisation zu verstehen. Lipidomik Das Lipidom ist die Gesamtheit aller Lipide einer Zelle oder eines Organismus zu einem BIOspektrum | 02.19 | 25. Jahrgang bestimmten Zeitpunkt unter definierten Bedingungen. Die Lipidomik befasst sich folglich mit der Analyse des Lipidoms. Durch die Verwendung neuester hochauflösender und sensitiver Massenspektrometer können heutzutage komplette Lipidomanalysen durchgeführt werden [4]. Dafür werden für gewöhnlich Lipide aus zellulärem Gewebe extrahiert [5, 6]. Anschließend werden sie direkt in shotgun-Experimenten oder nach Auftrennung mittels Flüssigkeitschromatographie massenspektrometrisch analysiert. Die Identifizierung der Lipide erfolgt anhand ihrer charakteristischen Fragmentspektren [7]. Aufgrund von Löslichkeitsproblemen sowie der unterschiedlichen Eigenschaften der verschiedenen Lipidklassen ist die Probenvorbereitung allerdings noch immer eine Her- ausforderung. Kürzlich wurde deshalb ein speziell für die Massenspektrometrie optimiertes Protokoll etabliert [8]. Wir haben eine neue und innovative Strategie entwickelt, welche die massenspektrometrische Lipidanalyse direkt aus der Lipiddoppelschicht ermöglicht [9]. Die Verifizierung dieser Methode erfolgte anhand von Modellliposomen. Liposomenpräparation Im ersten Schritt der Liposomenpräparation (Abb. 1) werden die in organischen Lösungsmitteln gelösten Lipide im gewünschten Verhältnis gemischt und das Lösungsmittel verdampft, sodass ein trockener Lipidfilm entsteht. Dieser Lipidfilm wird dann in flüchtigem Ammoniumacetat hydratisiert, wobei sich multilamellare Vesikel (MLVs) bilden. Diese bestehen aus mehreren zwiebelförmig angeordneten Lipiddoppelschichten. Mittels Extrusion durch eine Polycarbonatmembran definierter Porengröße werden dann MLVs in unilamellare Vesikel (ULVs, das heißt Liposomen) überführt. Die durchschnittliche Größe der gebildeten Liposomen kann dann durch dynamische Lichtstreuung bestimmt werden. Identifizierung der Lipide Zur Analyse der Lipide wurden diese direkt in das Massenspektrometer eingebracht. Es wird angenommen, dass die Liposomen während der Ionisierung vollständig dissoziieren und so die direkte Lipidanalyse aus Lipiddoppel- ˚ Abb. 1: Liposomenpräparation. Lipide verschiedener Klassen werden in den gewünschten Verhältnissen gemischt und das organische Lösungsmittel verdampft. Der trockene Lipidfilm wird in Ammoniumacetat hydratisiert. Die gebildeten multilamellaren Vesikel (MLVs) werden mittels Extrusion in unilamellare Vesikel (ULVs) einer bestimmten Größe überführt. Lipide können anschließend mithilfe der Massenspektrometrie (MS) identifiziert werden. PC: Phosphatidylcholin; PG: Phosphatidylglycerol. 168 W I S S EN S CH AFT · S PECIA L : L IQ UID H ANDLI NG & P ROBE NVORBE RE I T UNG A Mischungsverhältnisse der Lipide während der Liposomenpräparation wider (Abb. 3A). Die Linearität dieser Messungen ist über den gesamten Bereich der Lipidmischungen gegeben (Abb. 3B). Quantifizierung niedrig abundanter Lipide B ˚ Abb. 2: Lipididentifizierung. Im negativen und positiven Ionenmodus wurden Lipidspezies beobachtet. Anhand der Fragmentspektren (rechts) können die Lipide eindeutig identifiziert werden. A, Phosphatidylglycerol(PG)-Spezies, negativer Ionenmodus. B, Phosphatidylcholin(PC)Spezies, positiver Ionenmodus. A B Anschließend sollten niedrig abundante Lipide identifiziert und quantifiziert werden. Hierfür wurden Liposomen verwendet, welche zum Großteil aus PG und PS und zu einem geringen Anteil aus einem PI-Extrakt aus Soja präpariert wurden. Das aufgenommene Massenspektrum zeigt die PG- und PS-Spezies mit vergleichsweise hohen Intensitäten. Außerdem wurden zwei Signalverteilungen im Bereich m/z 831–837 und 857–865 beobachtet (Abb. 3C). Diese Signale wurden als PI-Spezies mit verschiedener Fettsäurezusammensetzung identifiziert. Ihr Anteil konnte durch Simulation der theoretischen Isotopenverteilungen bestimmt werden (Abb. 3D). Fazit C D ˚ Abb. 3: Quantifizierung von Lipiden aus Liposomenmembranen. A, zwei PG-Spezies, gemischt in variierenden Verhältnissen (2:1 und 1:50). B, Die relativen Intensitäten beider PG-Spezies sind linear. C, Liposomen, präpariert aus PG:PS:PI (1:1:0,3). Mehrere PI-Spezies wurden identifiziert (m/z 831–837 und 857–865). D, Anhand der theoretischen Isotopenverteilung wurden die Anteile der PI-Spezies bestimmt. PG: Phosphatidylglycerol; PC: Phosphatidylcholin; PS: Phosphatidylserin; PI: Phosphatidylinositol. schichten möglich ist (Abb. 1). In der Tat können im negativen und positiven Ionenmodus Lipidspezies mit entsprechenden Masse-zuLadung-Verhältnissen (m/z) beobachtet werden. Eine anschließende Isolierung und Fragmentierung ermöglicht die Identifizierung der Lipidspezies. In Abbildung 2 wurden eine PG-Spezies (m/z 773, negativer Ionenmodus) und eine PC-Spezies (m/z 786, positiver Ionenmodus) aus Liposomen identifiziert. Relative Intensitäten der Lipide Um zu testen, ob die hier vorgestellte Strategie auch eine Quantifizierung der Lipide ermöglicht, wurden zwei PG-Spezie (...truncated)