Deri Doku Mühendisliği Amaçlı Üç Boyutlu Biyobaskı ve Keratinosit Kültürü

Dicle Tıp Dergisi / Dicle Medical Journal (2018) 45 (1) : 9 - 18 Özgün Araştırma / Original Article Deri Doku Mühendisliği Amaçlı Üç Boyutlu Biyobaskı ve Keratinosit Kültürü Aylin Şendemir Ürkmez1, Umut Doğu Seçkin2, Cansu Görgün3, Yiğit Uyanıkgil4 1 Aylin Şendemir Ürkmez, Ege Üniversitesi, Mühendislik Fakültesi, Biyomühendislik Bölümü İzmir, Türkiye ORCID: 0000-0003-1818-6651 Ege Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Biyomühendislik ABD İzmir, Türkiye Ege Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Biyomedikal Teknolojiler ABD İzmir, Türkiye 2 Umut Doğu Seçkin, Ege Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Biyomühendislik ABD İzmir, Türkiye ORCID: 0000-0002-0123-0284 3 Cansu Görgün, Ege Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Biyomedikal Teknolojiler ABD İzmir, Türkiye ORCID: 0000-0002-0460-2952 Department of Experimental Medicine, University of Genova, Genova, İtalya U.O. Regenerative Medicine, Ospedale Policlinico San Martino, IRCCS perl'Oncologia, Cenova, İtalya 4 Yiğit Uyanıkgil, Ege Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Biyomedikal Teknolojiler ABD İzmir, Türkiye ORCID: 0000-0002-4016-0522 Ege Üniversitesi, Tıp Fakültesi, Histoloji ve Embriyoloji AD İzmir, Türkiye. Geliş Geliş: 07.09.2017, Revizyon: 26.10.2017, Kabul Tarihi: 06.12.2017 Özet Amaç: Bu çalışmada üç boyutlu biyoyazıcı için uygun bir biyomürekkep (hidrojel - hücre karışımı) üretilerek keratinosit hücrelerinin biyobaskısı hedeflendi.Elde edilen hidrojel yapılı epidermis doku kültüründe hücre proliferasyonu, canlılık analizi, hidrojel içinde hücre dağılımı ve morfolojisi belirlendi. Yöntemler: Hücre kültürlerinde derinin üst tabakası olan epidermiste bulunan keratinosit hücreleri kullanılmıştır. Karakterizasyonu daha önce tamamlanmış olan HS2 insan keratinosit hücre hattı, farklı biyopolimerhidrojeller (jelatin, aljinat, kitosan) ve karışımları içinde süspanse edilip biyobaskı için en uygun hidrojel bulundu. 3B keratinosit kültürleri deney başlatılmasından 1, 4 ve 7 gün sonra canlılık analizi için MTT testine ve hücre dağılımı ve morfolojisinin görüntülenmesi için Hematoksilen- Eozin boyamasına tabi tutuldu. Bulgular: Elde edilen MTT sonuçlarına göre hücre canlılıkları iki boyutlu (2B) kültürde elde edilen keratinosit canlılıklarının %50'sinden yüksek çıkmıştır. MTT sonuçları keratinositlerin üretilen hidrojel yapısı içerisinde tutunarak canlılıklarını sürdürebildiklerini göstermektedir. Elde edilen hücre içerikli polimerik hidrojelin histoloji için kesit alımına uygun olduğu ve alınan kesitlere uygulanan hematoksilen/eosin boyaması sonucunda da hücrelerin hidrojel içinde homojen olarak dağıldıkları ve canlılıklarını korudukları belirlenmiştir. Sonuç: Bu çalışmada oluşturulan epidermis benzeri doku kesitleri üç boyutlu biyoyazıcı ile üretilmiş ve keratin ositlerin hidrojeller içinde canlılıklarını sürdürüp doku iskelelerine tutundukları belirlenmiştir. Üretilen hidrojel biyomürekkeplerin deri doku mühendisliğinde ve özellikle yanıklarda epidermis tabakasının onarımında hızlı ve kişiye özel tedavi seçenekleri sunma potansiyeli vardır. Anahtar kelimeler: Biyoyazıcı, Üç boyutlu (3B) biyobaskı, Deri doku mühendisliği, Hidrojel DOI: 10.5798/dicletip.363931 Yazışma Adresi / Correspondence Yiğit Uyanıkgil, Ege Üniversitesi, Tıp Fakültesi, Histoloji ve Embriyoloji AD, 35100 İzmir, Türkiye e-mail: 9 Şendemir Ürkmez A., Doğu Seçkin U., Görgün C., Uyanıkgil Y. 3D Bioprinting and Cultivation of Keratinocytesfor Skin TissueEngineering Abstract Objective: Inthisstudy, production of a printablebio-ink (cell-hydrogelmixture), and bioprinting of keratinocytes were aimed. Cell proliferation, viability, distribution and morphology were evaluated within the epidermis-likehydrogels. Methods: Keratinocytes from epidermis layer,that is the upperlayer of skin tissue, wereused. Human keratinocyte cellline (HS2) that had been characterized before we resuspen ded with indifferent hydrogels (gelatin, alginate, chitosan) and the irmixtures to obtain the most suitable hydrogel for bioprinting. Bioprinted skin tissues were tested by MTT assay for viability analysis; and hematoxylin- eosin staining was performed for determination of cell distribution and morphology 1, 4 and 7 days after the beginning of the culture. Results: Accordingtothe MTT results, cellviabilitywasabove 50% of that of control 2-dimensional cultures. MTT results areindic ative of cell attachment and viability within the hydrogel structure. The resulting cell-laden polymeric hydrogel constructs were determined to be suitable for histological cross-sectioning, and hematoxylin/eosin histological staining indicated that cells were distributed homogenously within the hydrogels; and they retained their viability. Conclusion: It was shown that epidermis-like tissues were successfully produced using 3D bioprinting, and keratinocytes were able to attach the hydrogels and retain their viability. The se hydrogel bioinks have the potential for skin tissue engineering applications, and particularly in fast and personalized treatment of burns in dermislayer. Keywords: Bioprinter, Three-dimensional (3D) bioprinting, Skin tissueengineering, Hydrogel GİRİŞ Doku mühendisliği, doku yenilenmesi, organ fonksiyonlarının düzenlenmesi ve devamlılığı için mühendislik ilkelerinin yaşam bilimlerine uygulandığı disiplinler arası bir çalışma alanıdır1. Doku mühendisliği yaklaşımı, canlı hücrelerin in vitro ortamda biyo malzemelerden oluşan destek iskeleleri üzerinde üretilmesi ve elde edilen hücre-biyo malzeme yapısının vücuttaki hasarlı bölgeye yerleştirilmesi prensibine dayanmaktadır. Doku mühendisliği çalışmalarında uzun vadede temel amaç, görevini yapamayacak duruma gelmiş hasarlı organ yerine, hücre, doku iskelesi ve uyarıcı/düzenleyici faktörler kullanılarak üç boyutlu fonksiyonel yapay doku ve organların oluşturulmasıdır2-4. Üç boyutlu (3B) biyobaskı, doku yapılarını üç boyutlu formda oluşturmak için birbirini takip eden katman yaklaşımı kullanarak, hücre fonksiyonu ve canlılığını koruyarak biyouyumlu bir materyal içerisinde üç boyutlu doku basım işlemidir5. Üç boyutlu biyobaskı yöntemi ile karaciğer, böbrek, kan damarları, deri greftleri gibi yapıların oluşturulması konusunda çalışmalar sürmektedir6,7. Biyobaskı ile üretilen doku yapılarında hücrelerin canlılığı ve doku farklılaşmasına öncül olması için dış faktörlerin sıkı kontrolü sağlanmalıdır. Hidrojel bütünlüğünün korunması, oksijen transferi ve besi ortamı sürekliliği önemli parametrelerdendir. Bu yöntem ile kişiden biyopsi ile alınan doku örneklerinden ilgili hücreler izole edilip in vitro kültivasyonla istenen miktar ve şekilde üretilebilecek, organ transplantasyonunda alıcı ve verici arasında immün yanıtın ortadan kaldırılması 8 sağlanabilecektir . Doku mühendisliği uygulamaları, deri greftleri, hücresel tedavi, ilaç salım sistemlerinde kullanılan bu yöntem, hücrelerin fiziksel olarak in vivo benzeri üç boyutlu ortamda davranışlarının incelenmesine de olanak sağlamaktadır9,10. Epidermis kültürünün biyobaskısında ilk adım, (...truncated)