Pilze: vom „Vitamin“- Überproduzenten zum robusten Alleskönner

326 B I O T ECH NOLOGIE Mikrobielle Produktionssysteme Pilze: vom „Vitamin“- Überproduzenten zum robusten Alleskönner SUSANNE NIELAND 1, ARIEF I. ZAMANI 2 , C. LEONG NG 2 , K.-PETER STAHMANN 1 1 FACHGEBIET TECHNISCHE MIKROBIOLOGIE, BTU COTTBUS-SENFTENBERG 2 INSTITUTE OF SYSTEMS BIOLOGY, UNIVERSITI KEBANGSAAN MALAYSIA, BANGI Ashbya gosspyii, a fungus overproducing riboflavin, is applied for > 1000 t/a for two decades. Disadvantages of the overproducer are its need of complex nutrients and a weak pH tolerance. An omnipotent anabolism was shown for Phialemonium curvatum isolated from compost by screening for plant oil degradation on mineral salts medium at pH 3. It can be cultivated in plastic vessels > 100 L with minimal sterile technique. Its potential to convert crude palm oil into organic acids is discussed. DOI: 10.1007/s12268-021-1567-7 © Die Autoren 2021 ó Nach 50 Jahren Anlauf gelang Ende des letzten Jahrhunderts die Ablösung der siebenstufigen chemischen Synthese von Ribo- A C D B flavin durch mikrobielle Verfahren auf Basis pflanzlicher Rohstoffe [1]. Interessanterweise sind zwei Verfahren wirtschaftlich erfolgreich, eines mit dem filamentösen Pilz Ashbya gossypii und ein weiteres mit dem Gram-positiven Bakterium Bacillus subtilis. Beide Verfahren haben den Vorteil, einstufig zu sein. Ansonsten sind die Unterschiede so vielfältig, dass bisher keine Vorhersage möglich ist, welches Verfahren sich ökonomisch bzw. ökologisch durchsetzen wird [2, 3]. Die ehrgeizigere Stammentwicklung war die mit B. subtilis, denn hier gab es keine natürliche Überproduktion. Auch der molekulare Regulationsmechanismus war unbekannt. Zwar lassen sich in kurzer Zeit Antimetabolitresistente gelbe Klone gewinnen, die kommerziell relevanten Stämme tragen jedoch > 100 Mutationen. Der von Stammsammlungen erhältliche Wildtyp (WT) von A. gossypii produziert dagegen in einem einfachen Rührkessel (Abb. 1A) 100 Milligramm Riboflavin pro ¯ Abb. 1: RiboflavinProduktion in Ashbya gossypii A, A. gossypii produziert im 4-Liter-Rührkessel das gelbe Riboflavin. B, Ein Teil der Hyphenzellen akkumuliert dieses grün fluoreszierende Produkt (aus [4]). C, Die Deletion von SHM2 verbessert die Produktbildung, d. h. die Kolonie ist intensiver gelb gefärbt. D, Die erhöhte Produktion ist durch die Vorstufenfunktion des Glycins erklärbar. Dieses wird durch die Serinhydroxymethyltransferase (SHM2) in Serin umgewandelt. Durch die Deletion des SHM2-Gens steht mehr Glycin zur Verfügung. Von diesem werden beide C-Atome und der Stickstoff ins Riboflavin eingebaut. BIOspektrum | 03.21 | 27. Jahrgang 327 A Gramm Trockenbiomasse. Etwa die Hälfte der Hyphenzellen bildet und akkumuliert das gelbe Pigment, was sich mit grüner Fluoreszenz zeigt (Abb. 1B). In diesen Zellen findet man eine gesteigerte Expression der RIB-Gene, wie nach Umwandlung der Hyphen in Protoplasten und Trennung im Cellsorter erkennbar wird [4]. Die andere Hälfte bildet z. B. Sporen. Deswegen wird vermutet, dass Riboflavin beim Pilz eine Bedeutung für die Sporen hat. Die hyalinen Sporen überleben UV-Licht nur wenige Sekunden. Es konnte gezeigt werden, dass Riboflavin als Schutzpigment wirkt [5]. Die gentechnische Stammverbesserung bei A. gossypii ist erfolgreich. Ein überraschendes, aber vollständig aufgeklärtes Beispiel ist die Deletion des Gens für die cytosolische Serinhydroxymethyltransferase. ∆SHM2Mutanten wachsen langsamer, bilden aber mehr Riboflavin (Abb. 1C). Das liegt daran, dass weniger Glycin in Serin umgewandelt wird, wodurch mehr für die Biosynthese von GTP, der Vorstufe von Riboflavin (Abb. 1D), übrigbleibt. Supplementiert man die Kultur mit Adenin (1 mM), wird das WT-Wachstum wieder hergestellt, weil dieses den C1-Stoffwechsel entlastet [6]. Ein Vorteil beim Produktionsverfahren mit A. gossypii ist die Nutzung von Triglyceriden. Es können große Mengen in den Rührkessel gegeben werden, ohne Osmostress zu erzeugen. Die vom Pilz gebildete Lipase setzt – wegen einer kurzen Halblebensdauer und stringenter Regulation [7] – nur häppchenweise Fettsäuren frei, sodass keine unerwünschte Entkopplung der Atmungskette erfolgt. Palmöl: Selektivitätsförderndes Substrat – zertifizierter Anteil wächst langsam Die Nutzung pflanzlicher Triglyceride als einzige Kohlenstoff- und Energiequelle beschränkt die kultivierbaren Pilze auf Lipaseproduzenten (Abb. 2A). Senkt man den pH-Wert auf drei und setzt nur Salze als weitere Substrate ein, entstehen Selektivbedingungen. Die Verwendung von Nitrat anstatt Ammoniak als Stickstoffquelle erhöht die Selektivität [8]. Im Genom von A. gossypii findet man kein putatives Gen für eine Nitratreduktase, was eine Erklärung dafür ist, warum er auf diesem Medium nicht wächst (Abb. 3A). Das Kompostisolat Phialemonium curvatum dagegen (Abb. 2B) generiert aus Nitrat so viel Ammoniak, dass mit Mineralsäure titriert werden muss, um den pH-Wert BIOspektrum | 03.21 | 27. Jahrgang B C ˚ Abb. 2: Die Kultivierung von Phialemonium curvatum A, P. curvatum wächst unter Selektivbedingungen (rote Fläche). B, Der filamentöse Pilz bildet auf der Agarplatte ein strukturiertes Luftmyzel. C, In einem 500-Liter-Plastikbehälter ist eine Kultivierung mit minimaler Steriltechnik möglich. unter fünf zu halten. Steigt der pH-Wert an, kommt es zu bakteriellen Kontaminationen, welche die Pilzkultur überwachsen. Als Kohlenstoff- und Energiequelle eignet sich z. B. Rapsöl (R). Interessanter ist das seit Jahren in der Kritik stehende Palmöl (P), denn Flächenbedarf (R: 1,2 ha/t; P: 0,26 ha/t), Verbrauch an Dünger (R: 99 kg/t; P: 47 kg/t) und Pestiziden (R: 11 kg/t; P: 2 kg/t) sind geringer. Malaysia ist der zweitgrößte Hersteller von Palmöl [8]. Um die weitere Abholzung von Regenwald zu stoppen, hat die Regierung 2019 vier politische Ziele formuliert, z. B. die Begrenzung der Palmölpflanzung auf 6,5 Millionen Hektar [9]. Weltweit werden nur etwa 20 Prozent der Gesamtproduktion den über 40 Kriterien der Nachhaltigkeit gerecht. Um die Erhöhung dieses Anteils bemüht sich z. B. der „Roundtable on sustainable Palm Oil“. In Deutschland hat die freiwillige Selbstverpflichtung im Rahmen des Forums Nachhaltiges Palmöl e.V. im Jahr 2020 eine Zertifizierungsquote von 100 Prozent erreicht. Die mikrobielle Umsetzung zu langlebigeren und höherpreisigen Produkten – im Vergleich zu Biodiesel – könnte einen Weg aufzeigen, den Zertifizierungsanteil zu erhöhen. Phialemonium curvatum in 100-Milliliter- und 100-Liter-Kultur Der omnipotente Anabolismus von P. curvatum, kombiniert mit Selektivbedingungen (Abb. 3A), erlaubt eine monoseptische Kultur in nicht sterilen Plastikfässern [10]. Vergleicht man im 100-Liter-Maßstab die Investitionskosten (< 1 h/L) mit denen eines Stahlfermenters, lassen sich > 90 Prozent einsparen. Ein Indiz für die Robustheit des Systems ist, dass auch ungelernte Mitarbeiter mit 350-Liter-Kulturen (Abb. 2C) keine Kontaminationsprobleme haben [10]. Mögliche Produkte könnten polymerisierbare organische Säuren sein. Da bei Wachstum auf Fettsäuren die Isocitrat-Ly (...truncated)