Wie kleine Amyloid-β-Peptide zum großen Problem im Gehirn werden können

· M ETHOD E N 705 Proteincharakterisierung Wie kleine Amyloid-β β-Peptide zum großen Problem im Gehirn werden können RENÉ ZANGL, NINA MORGNER INSTITUT FÜR PHYSIKALISCHE UND THEORETISCHE CHEMIE, UNIVERSITÄT FRANKFURT A. M. The formation of amyloid-β oligomers plays a key role in the onset of Alzheimer’s disease. We investigated the aggregation of amyloid-β oligomers by mass spectrometry and ion mobility spectrometry, revealing those structural properties, which lead to the formation of mature fibrils. We can show that the arrangement of the first oligomers is crucial for the topology of the resulting species, leading to the formation of non-toxic aggregates or fibrils. DOI: 10.1007/s12268-021-1678-1 © Die Autorinnen und Autoren 2021 ó Aufgrund der steigenden Lebenserwartung stellen Demenzerkrankungen wie Alzheimer ein immer größer werdendes Problem unserer Gesellschaft dar. Gleichzeitig stehen für deren Behandlung keine Therapiemethoden zur Verfügung. Bei Patienten und Patientinnen mit Alzheimer wird ein Rückgang der Hirnmasse beobachtet, der auf das Absterben von Neuronen zurückzuführen ist [1]. Neben der Neurodegeneration wird das Auftreten von Proteinplaques im Gehirn beobachtet, die aus dem Amyloid-β-Protein aufgebaut sind. Diese Plaques galten lange als Auslöser der Erkrankung. Inzwischen geht man davon aus, dass es sich hierbei um ein Nebenprodukt handelt, während die kleineren, aus 42 Aminosäuren (AS) bestehenden Amyloid-β(Aβ42)-Oligomere als neurotoxisch gelten [2]. Amyloidbildung Die Bildung von Fibrillen lässt sich in drei Phasen unterteilen: In der ersten Verzögerungsphase liegt das amyloidogene Peptid primär in seiner monomeren Form vor. Durch Proteinfehlfaltungen wird die anschließende Wachstumsphase initiiert, bei der die autokatalytische Anlagerung weiterer Untereinheiten erfolgt, bis diese letztendlich in der Sättigungsphase endet, bei der hochgeordnete Fibrillen vorliegen (Abb. 1A, [3]). BIOspektrum | 07.21 | 27. Jahrgang Während das monomere Aβ42 als unstrukturiert gilt, finden während der Aggregation Änderungen in der Sekundär-, sowie Tertiärstruktur statt, die z. B. mittels Fluoreszenzassays, NMR oder Kryo-EM beobachtet werden können [4]. Insbesondere die KLVFF-AS-Sequenz sowie K28 scheinen entscheidend für die intramolekulare Interaktion zu weiteren Untereinheiten zu sein. Während die Fibrillen durch die genannten Methoden gut charakterisiert werden konnten, liegt derzeit der Fokus der Forschung auf den erstgenannten Phasen. Gerade die Anfälligkeit zur Aggregation, die ein Hauptziel der Untersuchungen darstellt, macht ebensolche Untersuchungen schwierig, da sich der oligomere Zustand nicht beliebig genau definieren lässt. Während die genannten analytischen Methoden stets ein Ensemble aus undefinierbaren oligomeren Zuständen betrachten, können individuelle Oligomere hierüber nicht separat charakterisiert werden. Untersuchung der Aggregation auf oligomerer Ebene Die von uns genutzte Methode ist die native Massenspektrometrie (MS), womit sich die unterschiedlichen Oligomere anhand ihres Masse-zu-Ladungs-Verhältnisses (m/z) klar voneinander separieren lassen. Mithilfe der laser-induced liquid bead ion desorption(LILBID)-MS konnte z. B. die frühe Aggregationsphase von Aβ42 untersucht werden [5]. Bei dieser Methode werden wässrige Analyttröpfchen mit einem Durchmesser von etwa 30 bis 50 Mikrometer bei einer Frequenz von 10 Hertz im Vakuum erzeugt, die anschließend von einem IR-Laserpuls bestrahlt werden, der zur Anregung der O-HStreckschwingung des Solvens führt. Diese führt zur explosionsartigen Expansion des Analyttröpfchens und zur Freisetzung von niedrig geladenen Ionen, die anschließend anhand ihres m/z-Verhältnisses analysiert werden (Abb. 1B). Diese Ionisationstechnik gilt als besonders sanft, wodurch sich die Aggregation auf oligomerer Ebene zeitlich verfolgen lässt. Eine weitere, häufig genutzte MS-Hybridtechnik ist die ElektrosprayIonenmobilitätsspektrometrie (ESI-IMS), worüber sich die Ionen neben ihrem m/zVerhältnis auch anhand ihrer Größe und Form unterscheiden lassen. Nach der sanften Ionisation werden Ionenpakete in eine mit Inertgas gefüllte Kammer überführt, durch welche die Ionen unter Einfluss einer sanften Spannung geleitet werden. Ionen mit einer größeren Oberfläche und somit einem größeren Kollisionsquerschnitt Ω (collision cross section, CCS) erfahren mehr Stöße mit dem Inertgas, wodurch diese für das Passieren der Kammer eine längere Driftzeit (dt) benötigen. Dies eröffnet die Möglichkeit, Ionen anhand ihrer oligomeren Größe und Konformation zu unterscheiden (Abb. 1C). Zudem können die experimentell ermittelten Driftzeiten in CCS umgerechnet werden, was den Vergleich mit theoretischen CCS von Modellstrukturen ermöglicht, wodurch auch strukturelle Informationen gewonnen werden können. Monomerer Grundstein als Fundament der Aggregation Durch die Kombination eines MS-Ionenmobilitätsspektrometers mit einem IR-Spektrometer konnten in früheren Studien diverse Modellpeptide analysiert werden, die zu höheren Aggregaten mit unterschiedlichen Morphologien fibrillieren [6]. Durch die 706 W I S S EN S CH AFT · ME TH ODE N te, bezüglich deren Durchmesser orthogonal zur Fibrillachse. Dieses Phänomen konnte ebenfalls bei der Analyse der CCS der jeweiligen Oligomere beobachtet werden, der abhängig vom untersuchten Modellpeptid, bei gleicher Peptidlänge, zu einem höheren oder niedrigeren CCS-Zuwachs bei einer Anlagerung einer zusätzlichen Monomeruntereinheit führt [7]. Bei Modellpeptiden, die einen geringen CCSZuwachs pro zusätzlicher Anlagerung aufweisen, war zudem die Amid-I-Bande bereits bei vergleichsweise niedrigen Oligomergrößen ausgeprägt. Dies deutet darauf hin, dass im Laufe der Aggregation die Anlagerung von je zwei weiteren Monomeruntereinheiten pro Ebene ähnlich dem Schließen eines Reißverschlusses zu erfolgen scheint. Im Gegensatz dazu sprechen ein hoher CCSZuwachs und eine schwächer ausgeprägte Amid-I-Bande sowie ein geringerer Durchmesser der resultierenden Fibrillen für eine Oligomerisierung von einer Monomeruntereinheit pro Ebene, analog einer Perlenkette (Abb. 2A, [7]). Ersterer Aggregationsaufbau liegt auch für Aβ42 nahe, da die bekannten Modelle vorrangig von einer reißverschlussartigen Struktur ausgehen [4]. Die Anwendung der CCS der jeweiligen Oligomere auf die genannten Modelle zeigt, dass im Fall von Aβ42 die Aggregation zunächst über ein isotropes Wachstum erfolgt, welches in ein geordnetes Fibrillwachstum übergeht, wobei der Grundstein für das folgende Wachstum bereits auf dimerer Ebene gelegt wird (Abb. 2B und C). A B C Unterschiedliche Aggregationswege für Aβ42 ˚ Abb. 1: Schematische Darstellung des Aggregationsverlaufs von Aβ42 sowie der Ionisationstechniken LILBID-MS und ESI-IMS-MS. A, Der Aggregationsverlauf lässt sich z. B. über die Fluoreszenzintensität interkalierender Farbstoffe verfolgen. In der Verzögerungsphase liegt Aβ42 primär im monomeren Zustand vor. Lagern sich diese über die Zeit aneinander, erf (...truncated)