ProFiT: eine MS-basierte Methode zur Skelettmuskelfasertypisierung

719 Methoden der Proteinforschung ProFiT: eine MS-basierte Methode zur Skelettmuskelfasertypisierung SEBASTIAN KALLABIS 1, MARCUS KRÜGER 1,2 1 CECAD RESEARCH CENTER, UNIVERSITÄT ZU KÖLN 2 ZENTRUM FÜR MOLEKULARE MEDIZIN KÖLN (ZMMK), UNIVERSITÄT ZU KÖLN Skeletal muscle tissue is composed of different fiber types which differ in their metabolic activity and molecular expression patterns. Mass spectrometric analyses revealed muscle fiber-specific traits but the number of detected proteins is limited due to low protein abundance and high dynamic range. We have developed a new LC-MS/MS method to circumvent the bottleneck of low protein abundance and we have applied this method to measure fiber type-specific phosphoproteomes for the first time. DOI: 10.1007/s12268-021-1671-8 © Die Autoren 2021 ó Der menschliche Körper besteht zu 30–40 Prozent aus Skelettmuskeln, die in mehr als 650 verschiedene Muskeln einteilbar sind. Jeder Muskel besteht aus einer großen Anzahl an Muskelfasern, jede Faser wiederum enthält viele parallel angeordnete Myofibrillen. Diese setzen sich aus aneinandergereihten Sarkomeren zusammen und sind die kleinste funktionelle Einheit eines Muskels. Im Sarkomer erzeugt eine Adenosintriphosphat(ATP)-abhängige Interaktion zwischen Myosin- und Aktinfilamenten schließlich die eigentliche Muskelkontraktion, die auch als cross bridge cycle beschrieben wird [1]. Auf molekularer Ebene wird die Einteilung der Skelettmuskelfasern bezüglich ihrer Ausdauer und Kontraktionsgeschwindigkeit u. a. durch die Expression unterschiedlicher Myosine (MYH) reguliert (Abb. 1A). Bei Säugetieren gibt es vier verschiedene Muskelfasertypen. Langsame Typ- ˘ Abb. 1: Bestimmung von Muskelfasertypen. A, Fasertypcharakteristika. B, Detektion oxidativer Fasertypen (gekennzeichnet mit *) mittels des Succinat-Dehydrogenase-Assays. C, antikörperbasierte Immunfluoreszenz gegen fasertypspezifische Myosine. Maßstabsbalken: 100 μm. Arbeitsablauf zur Auftrennung (D), Quantifizierung (E) und Identifizierung (F) tryptischer Peptide mittels LC-MS/MS. BIOspektrum | 07.21 | 27. Jahrgang I-Fasern exprimieren MYH7, weisen die geringste Kontraktionsgeschwindigkeit auf und produzieren ATP größtenteils durch oxidative Phosphorylierung innerhalb der Mitochondrien (Abb. 1B, C). Schnelle Typ-IIAFasern exprimieren MYH2, Typ-IIX-Fasern MYH1 und Typ-IIB-Fasern MYH4. Die Kontraktionsgeschwindigkeit der IIX-Fasern liegt dabei zwischen den langsameren IIAund den schnelleren IIB-Fasern [2]. Typ-IIBFasern gewinnen ATP hauptsächlich durch Glykolyse und ermüden deutlich schneller als oxidative Typ-I-Fasern. Zusätzlich existieren gemischte Fasertypen, z. B. Typ I/IIA, IIA/IIX oder IIX/IIB, die Merkmale mehrerer Typen aufweisen [3]. A B D C E F 720 W I S S EN S CH AFT · S PECIA L : PROTE INANALYTI K A Jeder Muskel hat eine individuelle Zusammensetzung an Fasertypen und reagiert dementsprechend unterschiedlich auf externe Stimuli, z. B. Training, Ernährung oder Erkrankungen. Fasertypspezifische Untersuchungen der Muskeln sind essenziell, um die Physiologie und molekularen Anpassungsmechanismen der Skelettmuskulatur besser zu verstehen. B Biochemische Methoden zur Bestimmung von Muskelfasertypen C ˚ Abb. 2: ProFiT-Arbeitsablauf. A, Isolation einzelner Muskelfasern aus Muskeln und Proteinextraktion. B, 10 Prozent der Lysate werden auf eine Testplatte übertragen, tryptisch verdaut und mittels einer kurzen LC-MS/MS-Methode analysiert. C, Nach Bestimmung der Fasertypen mittels Myosin-Expressionslevel werden gleiche Fasertypen vereinigt. Adaptiert nach [7]. A B Bisher wurde eine Vielzahl biochemischer Methoden zur Bestimmung von Muskelfasertypen entwickelt. Myosin-ATPase-Aktivitätsassays oder immunhistologische Anfärbungen fasertypspezifischer Myosine auf Muskelschnitten haben dazu beigetragen, molekulare Mechanismen der Skelettmuskulatur zu verstehen [4]. In den letzten Jahren hat sich zusätzlich die Massenspektrometrie (MS) als analytisches Werkzeug für eine unvoreingenommene Analyse globaler Proteinexpressionsmuster (Proteomik) in Muskelfasern etabliert [5, 6]. In der von uns verwendeten shotgun-Proteomik (LC-MS/MS) werden Proteingemische zunächst enzymatisch mittels der Endoprotease Trypsin verdaut. Nach Aufreinigung der Peptide werden diese mittels Umkehrphasenchromatographie aufgetrennt, um die Komplexität der Probe zu verringern (Abb. 1D). Die Signalintensitäten intakter C D ˚ Abb. 3: Anwendungsmöglichkeiten. A, Fasertypverteilungen bestimmt durch ProFiT (Balken: % MYH-Isoform/Faser) und Immunhistochemie. B, TPM1/MYH4-Expression in TA und EDL der Maus. MYH4-positive Fasern markiert durch a (TA) oder b (EDL). C, MYL1-Protein- und -Phosphopeptidlevel in Typ-I- und Typ-IIA-Muskelfasern. D, Titin-Phosphorylierung in Typ-I- und Typ-IIA-Muskelfasern. Adaptiert nach [7]. BIOspektrum | 07.21 | 27. Jahrgang Peptide werden zur Quantifikation verwendet (Abb. 1E) und Peptidfragmentierungsmuster erlauben, nach Abgleich mit einer Proteindatenbank, die Identifikation der Peptidsequenz (Abb. 1F). Trotz vieler Vorteile globaler Proteomikexperimente ist die Analyse komplexer biologischer Proben auch limitiert. In Muskelfasern dominieren einige Dutzend strukturelle und sarkomerische Proteine (u. a. MYH), während der Großteil anderer Proteine deutlich niedriger konzentriert vorliegt. Diese hohe Dynamik erschwert die Detektion gering exprimierter Proteine, da in LC-MS/MS-Analysen hoch konzentrierte Peptide bevorzugt werden. Zusätzlich beeinträchtigt die geringe Menge des Probenmaterials einzelner Muskelfasern die LC-MS/MS-Analyse. ProFiT – eine robuste Methode zur Charakterisierung von Muskelfasertypen Um das Problem geringer Proteinmengen einzelner Fasern zu umgehen, haben wir die ProFiT(proteomics fiber typing)-Methode zur schnellen und robusten Bestimmung von Muskelfasertypen mittels LCMS/MS entwickelt [7]. Die Probenvorbereitung erfolgt folgendermaßen: Nach der Isolierung verschiedener Muskeln, wie Soleus und Extensor digitorum longus (EDL) aus dem Hinterbein der Maus, werden einzelne Muskelfasern aus der extrazellulären Matrix mittels Collagenaseverdau gelöst und die Proteine extrahiert. Im nächsten Schritt werden ca. zehn Prozent der Proteinlysate entnommen und für die massenspektrometrische Bestimmung der Muskelfasertypen mittels ProFiT verwendet (Abb. 2A). Da Myosine zu den abundantesten Proteinen im Muskel gehören, reichen kurze chromatographische Gradienten von ca. fünf Minuten aus, um die am häufigsten vorkommenden Proteine zu detektieren und daraus den jeweiligen Fasertypen zu bestimmen (Abb. 2B). Beispielsweise ist eine Typ-I-Faser dadurch charakterisiert, dass MYH7 zu mehr als 80 Prozent der Gesamtmenge aller muskelspezifischen Myosine beiträgt. Zusätzlich können auch gemischte Fasertypen, die mehrere Myosine exprimieren, akkurat identifiziert werden. Da wir für ProFiT nur ca. zehn Prozent der Muskellysate verwenden, kann das restliche Lysat jeder einzelnen Probe mit Fasern des gleichen MuskelfaBIOspektrum | 07.21 | 27. (...truncated)