Eintauchen in die Sprache der Pilze

34 W I S S EN S CH AFT · ME TH ODE N Chemische Ökologie Eintauchen in die Sprache der Pilze MAARIA ROSENKRANZ, JÖRG-PETER SCHNITZLER ABTEILUNG FÜR EXPERIMENTELLE UMWELTSIMULATION, INSTITUT FÜR BIOCHEMISCHE PFLANZENPATHOLOGIE, HELMHOLTZ ZENTRUM MÜNCHEN, NEUHERBERG Fungi produce a wide variety of volatile organic compounds (VOCs), chemical cues with central roles in mediating interspecific interactions. Here we present a platform consisting of 14 cuvettes and 2 types of mass spectrometers, that allows for the first time automated, real-time analysis of various microbial VOCs. We used this platform to comprehensively analyze the VOCs of 43 fungal species. The further computational analyses reveal fundamental links between VOCs and ecological functions of fungi. DOI: 10.1007/s12268-022-1705-x © Die Autorinnen und Autoren 2022 ó Pilze sind Schlüsselkomponenten in terrestrischen Ökosystemen und nehmen wesentliche Funktionen in globalen biogeochemischen Kreisläufen ein [1]. Die vielfältigen Beziehungen, die sie zu Pflanzen, Mikroben und anderen Organismen eingehen, beeinflussen die ökologischen Funktionen von Pilzen [1, 2]. Um solche Beziehungen zu initiieren und zu regulieren, nutzen Pilze verschiedene Metabolite, darunter flüchtige organische Verbindungen (volatile organic compounds, VOCs). VOCs sind Verbindungen auf Kohlenstoffbasis, die aufgrund ihrer Flüchtigkeit in der Lage sind, durch die Atmosphäre und im Boden zu diffundieren [3]. Pilze – eine unerforschte Quelle für flüchtige Metabolite Pilzaromen sind zwar bekannte kulinarische Bestandteile vieler Speisen, doch der Wissenschaft wurde erst im letzten Jahrzehnt klar, welch riesige, unerforschte Quelle pilzliche VOCs darstellen [2]. Neben ihrer Verwendung bei der Artbestimmung, bei der Überwachung von Schimmelbelastung in Räumen, beim Kochen und in Lebensmitteln wie Käse sind Pilzaromen von entscheidender Bedeutung für die Biologie verschiedener Ökosysteme. Pilzliche VOCs können in anderen Arten Veränderungen in Wachstum, Fortpflanzung und Abwehr auslösen und darüber hinaus als Lockmittel für andere Organismen wirken [2, 3]. Aufgrund dieser kommunikationsähnlichen Eigenschaften werden VOCs manchmal auch als Sprache der Pilze bezeichnet. Herausforderung: chemische Kommunikation von Pilzen Die ganzheitliche Erfassung von VOC-Profilen ist eine Voraussetzung, um die Mechanismen der durch pilzliche VOCs vermittelten Kommunikation aufzuklären. Bisher wurden jedoch nur wenige Pilzarten systematisch untersucht [2, 4]. Da wir in unserer Forschungsgruppe über die notwendige Ausrüstung und das Wissen verfügen, haben wir uns der Herausforderung gestellt, die flüchtigen Fingerabdrücke verschiedener Pilzarten zu entziffern (Abb. 1). Unser Ziel war es, ein Hochdurchsatz(HTP)-System zu entwickeln, das die Echtzeitanalyse einer großen Anzahl von pilzlichen (wie auch mikrobiellen) Proben gleichzeitig ermöglicht. Automatisierte Plattform screent pilzliche und mikrobielle Düfte ˚ Abb. 1: Flüchtige Muster von Pilzen sind individuell wie Fingerabdrücke und können als Biomarker für Pilze verwendet werden. Reinkulturen von Pilzen emittieren charakteristische komplexe Muster an VOCs, die einzigartig sind. Die Muster und das Mischungsverhältnis der einzelnen Verbindungen können in einen Barcode/Fingerabdruck übersetzt werden. Unter Anwendung von maschinellem Lernen können daraus Biomarker identifiziert werden [5], die es ermöglichen, die Zugehörigkeit einer Art zu einer Nische oder Lebensform vorherzusagen. Die hier dargestellte Methode ist nicht auf Pilze beschränkt. Sie eröffnet vielfältige Anwendungsmöglichkeiten in der Grundlagenforschung, Lebensmittelherstellung und Überwachung wie auch im Gesundheitsbereich und der Innenraumüberwachung. Die Arbeiten begannen mit dem Aufbau einer VOC-Screening-Plattform, die eine sequenzielle Echtzeitmessung von Proben ermöglicht. Die Plattform besteht aus einem automatisierten Küvettensystem und zwei Arten von Massenspektrometrie (Abb. 2). Die beiden massenspektrometrischen Methoden, Protonentransferreaktion-Flugzeit-Massenspektrometrie (PTR-ToF-MS) und Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS) wählten BIOspektrum | 01.22 | 28. Jahrgang 35 wir, da sie sich gut ergänzen [5]. Zunächst werden die VOC-Emissionen mit dem PTRToF-MS gemessen. Dieses MS ermöglicht Echtzeitmessungen, um zeitliche Dynamiken mit sehr niedriger Nachweisgrenze zu erfassen. Das Online-MS erkennt besonders polare, niedermolekulare Verbindungen (Abb. 2A). Eine Ventilsteuerung (Abb. 2A) erlaubt das sequenzielle Vermessen der VOCs aus den Küvetten über einen beliebigen Zeitraum, im dargestellten Beispiel über 48 Stunden. Nach Abschluss der Online-Analysen werden die VOCs in der Gasphase der Küvetten mithilfe einer passiven Probennahmetechnik basierend auf den Adsorptionseigenschaften von Polydimethylsiloxan weiter gesammelt (Abb. 2A). Diese Proben werden dann durch GC-MS offline analysiert [5]. Der Vorteil von GC-MS gegenüber PTRToF-MS besteht darin, dass Isomere mit unterschiedlichen Massen über das Massezu-Ladungs-Verhältnis (m/z) getrennt werden können (Abb. 2B). Über den Vergleich von Molekülmassen und Fragmentmustern mit Spektrenbibliotheken können Verbindungen wie Sesquiterpene identifiziert werden, die eine hohe Isomerenvielfalt aufweisen. Bei der nicht zielgerichteten PTR-ToFMS-Methode hingegen besteht die große Herausforderung vor allem in der Identifizierung der detektierten Massen [4, 5]. Hierbei helfen Veröffentlichungen sowie die mVOCDatenbank [6], um Summenformeln zu bestimmen und bestimmte VOCs anhand ihrer charakteristischen m/z zu identifizieren. Auswahl der Pilzarten Um umfassende und valide Aussagen zu pilzlichen VOC-Mustern treffen zu können, haben wir repräsentative Pilzarten aus den drei Stämmen Ascomycota, Basidiomycota und Zygomycota ausgewählt. Wir achteten auch darauf, verschiedene ökologische Nischen (wie Nahrungsbeziehungen, Lebensstil, Substratnutzung und Wirtsarten) mit unserer Auswahl an Pilzen abzudecken [4]. Unsere Pilzauswahl umfasste solche Arten wie die Pflanzensymbionten Porphyrwulstling und Zweifarbiger Lacktrichterling, die Pflanzenpathogene Sparriger Schüppling und Schwarzschimmel sowie verschiedene zersetzende Pilze, wie Penicillium-Arten. Frühere Studien zeigten, dass die VOC-Emission von Pilzen von verschiedenen Umweltbedingungen abhängt, wie dem Entwicklungsstadium und der Nährstoffverfügbarkeit [3, 5]. Um diese Einflüsse im vorliegenden VerBIOspektrum | 01.22 | 28. Jahrgang A B ˚ Abb. 2: Systematische Analyse von VOC-Mustern von Pilzen. A, Schema eines Mehrfachküvettensystems gekoppelt mit Online- und Offline-Massenspektrometrie (ProtonentransferreaktionFlugzeit-Massenspektrometer (PTR-ToF-MS) und Gaschromatographie-Massenspektrometer (GC-MS)) [5]. Die Fotos zeigen den Aufbau der Anlage im Brutschrank, Kulturgefäße mit Polydimethylsiloxan-Passivsammlern (PDMS), die über Magnete an der Innenseite der Deckel angebracht sind, und Fotos der beiden Massenspektrometer. Zur Online-Messung von (...truncated)