30 Jahre Nanobodies: Neues von kleinen Helfern mit großem Potenzial

145 Antikörper 30 Jahre Nanobodies: Neues von kleinen Helfern mit großem Potenzial TERESA R. WAGNER 1,2 , SANDRA BURGSTALLER 1,3 , DESIREE I. FRECOT 1,2 , ROBERT LUKOWSKI 3 UND ULRICH ROTHBAUER 1,2 1 PHARMAZEUTISCHE BIOTECHNOLOGIE, UNIVERSITÄT TÜBINGEN 2 NMI NATURWISSENSCHAFTLICHES UND MEDIZINISCHES INSTITUT AN DER UNIVERSITÄT TÜBINGEN 3 PHARMAKOLOGIE, TOXIKOLOGIE UND KLINISCHE PHARMAZIE, UNIVERSITÄT TÜBINGEN 2023 marks the 30th anniversary of the discovery of single-domain antibody fragments in camelids, better known as nanobodies. This was the starting point for their tremendous success story in biomedicine. Here we highlight recent advances in the development of nanobodies for the detection of neutralizing SARS-CoV-2 antibodies, as biosensors for monitoring extracellular metabolites and as tracer molecules for non-invasive imaging of immune cells. DOI: 10.1007/s12268-023-1900-4 © Die Autorinnen und Autoren 2023 ó 2023 feiern wir den 30. Jahrestag der Entdeckung der Schwere-Ketten-Antikörper (heavy-chain-only antibodies) aus Kameliden und damit den Beginn der biomedizinischen Erfolgsgeschichte der EinzeldomänenAntikörpern, den Nanobodies (Nbs) [1]. Im Vergleich zu konventionellen Antikörpern vom Immunglobulin-G(IgG)-Typ, haben Nbs einzigartige Vorteile. Mit einem Molekulargewicht von ∼15 kDa bei einer Größe von ca. 2 × 4 nm sind sie nicht nur 10-fach kleiner als IgGs, sondern zeichnen sich auch durch hohe Löslichkeit, thermische und chemische Stabilität, kostengünstige Produktion, hohe Gewebepenetration und geringe Immunogenität aus. Gleichzeitig lassen sie sich effektiv und flexibel sowohl chemisch als auch genetisch funktionalisieren [2]. Aufgrund dieser Eigenschaften werden Nbs zunehmend in der biomedizinischen Forschung sowie in der Diagnostik und Therapie in vielfältigen Formaten eingesetzt. Im Folgenden stellen wir drei Anwendungsmöglichkeiten von Nbs als Antikörpersurrogate, BiosensorFusionskonstrukte und PET-Tracer als Beispiele für das große Potenzial dieser Bindemoleküle vor. SARS-CoV-2 – Überwachung des Immunstatus mittels Nanobodies Mit dem Ausbruch der COVID-19-Pandemie wurden schnell verfügbare Diagnoseverfahren zur Abschätzung des Infektionsausmaßes sowie des Schutzes durch neu entwickelte Impfungen in der Bevölkerung benötigt. Studien haben schon früh gezeigt, dass ein Immunschutz durch neutralisierende Antikörper vermittelt wird, welche die rezeptorbindende Domäne (RBD) blockieren, mit der das Spike-Protein des SARS-CoV-2-Virus an das Angiotensin-Converting-Enzym 2 146 W I S S EN S CH AFT · S PECIA L : M OLE KULARE ME DIZIN & VI ROLOGIE A C B ˚ Abb. 1: NeutrobodyPlex-Prinzip. A, Zur Entwicklung von Nanobodies (Nbs), die spezifisch die rezeptorbindende Domäne (RBD) des Spike-Proteins von SARS-CoV-2 erkennen, wurden aus einem immunisierten Alpaka verschiedene variable Domänen von Schwere-Ketten-Antikörpern gentechnisch isoliert. Die Interaktion zwischen dem Spike-Protein und dem Angiotensin-Converting-Enzym 2 (ACE) wird durch RBD-spezifische Nbs im monovalenten oder bi-paratopischen Format blockiert. B, NeutrobodyPlex: Zur Bindung von Antikörpern werden SARS-CoV-2-Antigen-gekoppelte Beads mit Patientenserum inkubiert. Durch Zugabe von bipNbs werden spezifisch die neutralisierenden Antikörper verdrängt. C, Die Abnahme des Signals auf RBD mit zunehmender bipNb-Konzentration entspricht der Menge an neutralisierenden Antikörper im Serum, während das Signal auf Spike die gesamte Antikörperantwort widerspiegelt. Erstellt mit BioRender.com. A B C ˚ Abb. 2: Nanobody-fusionierte Biosensoren. A, FRET-basierte Biosensoren werden über Nb/Antigen-Interaktion spezifisch auf Zelloberflächen immobilisiert. Dies ermöglicht eine räumlich aufgelöste Quantifizierung von Veränderungen extrazellulärer Ionen und Metaboliten, z. B. K+. B, Lebendfluoreszenzfärbung von SPOT-Tag+ murinen Neuronen mit SPOT-Nb-K+-Biosensor und quantitative Analyse des K+-spezifischen FRET-Signals nach Glutamatbzw. K+-Zugabe. C, Lebendfluoreszenzfärbung von Her2+-Zellen mit Her2-Nb-K+-Biosensor und K+-spezifische FRET-Ratio nach Permeabilisierung. Erstellt mit BioRender.com. BIOspektrum | 02.23 | 29. Jahrgang 147 (ACE2) bindet, um Zellen zu infizieren. Die schnell entwickelten serologischen SARSCoV-2-Antikörpertests konnten allerdings nicht zwischen neutralisierenden und nicht neutralisierenden Antikörpern unterscheiden. Um die Neutralisationskapazität von Serumproben zu bestimmen, wurden zeitund arbeitsaufwendige Virusneutralisationstests durchgeführt. Unser Ziel war es daher, Nbs als Antikörpersurrogate zu entwickeln, mit denen sich neutralisierende Antikörper in Serumproben im Hochdurchsatzverfahren nachweisen lassen. Dazu haben wir im ersten Schritt aus einer Nb-Genbibliothek eines mit der RBD von SARS-CoV-2-immunisierten Alpakas eine Vielzahl an Nbs selektiert und durch detaillierte Epitop-Kartierungen und Kristallstrukturanalysen Kandidaten identifiziert, die unterschiedliche Bereiche der RBD binden und funktionell eine Interaktion der RBD mit ACE2 inhibieren (Abb. 1A). Im zweiten Schritt wurden die zwei wirksamsten Nb-Kandidaten mit unterschiedlichen Bindeepitopen zu einem bi-paratopischen (bip) Nb fusioniert. Damit konnten wir nicht nur eine synergistische Inhibition der RBD/ ACE2-Interaktion erzielen, sondern auch die Bindungseigenschaften der Nbs für mutierte Versionen der RBD, wie sie in kontinuierlich neuen SARS-CoV-2-Varianten entdeckt wurden, sicherstellen. Um abschließend neutralisierende Antikörper in Serumproben nachzuweisen, wurden die bipNbs als Antikörpersurrogate in einem kompetitiven Bindungstest, dem NeutrobodyPlex, eingesetzt (Abb. 1B, [3]). Durch die gezielte Verdrängung der neutralisierenden Serumantikörper durch anti-RBD-bipNbs ließ sich die Neutralisierungskapazität von Serumproben von infizierten oder geimpften Personen quantitativ bestimmen (Abb. 1C). Diese indirekte Messung der Antikörperspiegel lieferte nach Automatisierung innerhalb weniger Stunden Ergebnisse bei einer Vielzahl an Proben. In Summe ist es mithilfe des NeutrobodyPlex nun möglich, den Immunstatus großer Populationen kontinuierlich zu überwachen und beispielsweise den Erfolg von Impfkampagnen in der Bevölkerung zu beurteilen [3]. Nanobody-fusionierte Biosensoren: quantitative Detektion extrazellulärer Ionen und Metabolite in Echtzeit Mit FRET-(Förster-Resonanz-Energietransfer)basierten Biosensoren lassen sich op tisch Veränderungen extrazellulärer Ionen und Metabolite in biologischen Systemen quantitativ bestimmen. Eine bis dato ungelöste Herausforderung liegt jedoch darin, diese Änderungen bestimmten Zellen bzw. Geweben zuzuordnen und ortsaufgelöst zu messen. Vor diesem Hintergrund bieten Nbs als kleine und biotechnologisch einfach zu manipulierende Bindemoleküle neue Möglichkeiten, Biosensoren spezifisch an Zielgewebe zu immobilisieren. Um dieses Potenzial zu testen, wurden Nbs genetisch an bekannte fluoreszierende FRET-Biosensoren gekoppelt, die auf K+-, pH- und Glukoseänderungen reagieren [4 (...truncated)