Membranproteinsynthese: Zellfrei geht’s schneller!

0 RITA SACHSE, ROBERT B. QUAST, ANDREI SONNABEND, MARLITT STECH, STEFAN KUBICK FRAUNHOFER-INSTITUT FR ZELLTHERAPIE UND IMMUNOLOGIE (IZI), INSTITUTSTEIL BIOANALYTIK UND BIOPROZESSE (IZI-BB) , POTSDAM-GOLM Difficult to express membrane proteins represent an increasing amount of therapeutic molecules. Considerable optimization is often required for downstream applications such as assay development and functional characterization. Cell-free systems emerged as powerful tools for the synthesis of structurally and functionally divergent membrane proteins. Vesicle-based eukaryotic cell-free systems enable co-translational protein translocation and posttranslational modifications. Hence, these systems provide a multitude of options for membrane protein studies. - Konventionelle Methoden zur Herstellung von Membranproteinen beruhen auf der berexpression der Proteine in Zellkulturen (in vivo). Der unumgngliche Eingriff in den Stoffwechsel lebender Zellen bei der berexpression von Membranproteinen hat jedoch hufig einen negativen Einfluss auf den Wirt. Es kommt zu toxischen Effekten, fehlendem Transport in Zielmembranen sowie einem raschen proteolytischen Abbau. Dies sind einige der Grnde, warum bisher nur eine verhltnismig geringe Anzahl von Membranproteinen funktionell und strukturell detailliert charakterisiert wurde. Eine Lsung dieses Problems ist der zellunabhngige (in vitro) Einsatz der biologischen Proteinsynthesemaschinerie zur Herstellung von Membranproteinen. Zellfreie Proteinsynthesesysteme nutzen translationsaktive Zellextrakte (Lysate), um funktionell aktive Membranproteine unter individuell optimierten Bedingungen herzustellen und damit deren spezifische Eigenschaften fr weitergehende analytische Verfahren zu erhalten. Abb. 1: Zellfreie Membranproteinsynthese in eukaryotischen Systemen. A, Das de novo synthetisierte Membranprotein wird whrend der Synthese in die endogenen Mikrosomen transloziert. B, Die zellfreie Synthese von Membranproteinen kann u. a. in Batch-Reaktionen (oben) oder Dialysesystemen (unten) durchgefhrt werden. Dialysesysteme erbringen eine Ausbeute von ca. 50 Mikrogramm pro Milliliter im Vergleich zu etwa 10 Mikrogramm pro Milliliter in Batch-Reaktionen, abhngig vom Proteintyp und Lysat. Abb. 2: Charakterisierung zellfrei synthetisierter Membranproteine in endogenen Mikrosomen. A, Konfokalmikroskopische Aufnahme eines mit eYFP (enhanced yellow flourescent protein) fusionierten G-Protein-gekoppelten Rezeptors (GPCRs) in Mikrosomen. B, Funktionsnachweis des 2-adrenergen Rezeptors mittels eines Dihydroalprenolol(DHA)-Radioligand-Bindungsassays (blau) im Vergleich zur Kontrolle (rot). C, Elektrophysiologische Charakterisierung des zellfrei synthetisierten tetrameteren Kaliumionenkanals KcsA. Ein bedeutender Vorteil zellfreier Systeme ist ihr offenes Design. Hiermit ist es mglich, dem System Komponenten extern zuzufhren, um die Qualitt und Quantitt des Proteins zu beeinflussen. Einen weiteren essenziellen Vorteil bietet die Verwendung eukaryotischer Lysate [1, 2]. Insbesondere die mit diesen Lysaten bereitgestellten Membranstrukturen (Mikrosomen) sind ein wichtiges Charakteristikum. Sie stammen aus der Membran des zelleigenen endoplasmatischen Retikulums und besitzen Proteine, die sie zur Translokation befhigen. Somit ist auch in zellfreien eukaryotischen Systemen eine gerichtete Integration von Membranproteinen in eine biologische Membran mglich. Diese Integration ist fr die Funktionalitt von Membranproteinen essenziell, da hierbei u. a. die korrekte Proteinfaltung und die Ausbildung der nativen Konformation untersttzt werden. Auch posttranslationale Modifikationen, wie beispielsweise die Abspaltung des Signalpeptids, N-Glykosylierung sowie Lipidmodifikationen finden innerhalb der Mikrosomen statt [35]. Eine schematische Darstellung der Synthese von Membranproteinen in eukaryotischen zellfreien Systemen ist in Abb. 1 gezeigt. Zellfreie Produktion von GPCRs und Ionenkanlen G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) stellen die grte Gruppe von Membranproteinen dar. Diese Klasse der heptahelikalen Rezeptoren spielt eine wichtige Rolle bei der bertragung von biologischen Signalen ber die Plasmamembran in das Zellinnere und lst damit eine Aktivierung der zytoplasmatischen Signaltransduktionswege aus. Aufgrund der herausragenden Rolle der GPCRs in diversen Signaltransduktionskaskaden sind sie ein Hauptziel der sich auf dem Markt oder in der Entwicklung befindlichen Pharmaka. Ein besseres Verstndnis der Wirkmechanismen von GPCRs durch Untersuchung der Struktur und Funktion dieser Proteine ist aufgrund ihrer vielfltigen Funktionen von besonderem Interesse. Das Beispiel des 2-adrenergen Rezeptors (2AR) zeigt, dass eine effiziente und zeitsparende Synthese mit einer anschlieenden funktionellen Charakterisierung von GPCRs in eukaryotischen zellfreien Systemen mglich ist (Abb. 2). Anhand von Radioligand-Bindungsstudien konnte z.B. im Anschluss an eine nur 90 Minuten dauernde zellfreie Synthese des 2AR die spezifische Bindung des Agonisten (Dihydroalprenolol, DHA) an den Rezeptor nachgewiesen werden (Abb. 2B). Zustzlich knnen GPCR-enthaltende Mikrosomen zu groen Vesikeln (giant unilamellar vesicles, GUV) umgebaut werden und bilden damit ein System fr mikroskopische Einzelmoleklanalysen zur Charakterisierung der Zielproteine [4, 6]. Die Synthese von komplexen Membranproteinen unter Verwendung von Mikrosomen-haltigen eukaryotischen Zelllysaten bietet eine einfache und effiziente Verfahrensweise zur Herstellung von funktionellen GPCRs, aber auch multimere Ionenkanle knnen in diesen Systemen dargestellt werden. So konnte beispielsweise der Kaliumkanal KcsA zellfrei synthetisiert und anschlieend durch Vesikelfusion in planaren Bilayern mittels elektrophysiologischer Messungen funktionell charakterisiert werden (Abb. 2C, [7]). Eukaryotische Lysate in Dialysesystemen Die zellfreie Synthese von Membranproteinen kann in verschiedenen Reaktionsformaten durchgefhrt werden. Hierbei erfreuen sich besonders sogenannte Eintopf- oder Batch-Reaktionen groer Beliebtheit. Batchbasierte Systeme eignen sich zur anwenderfreundlichen, einfachen und schnellen Synthese eines Zielproteins. Sie sind zwar durch kurze Reaktionszeiten gekennzeichnet, fhren jedoch hufig auch zu relativ geringen Gesamtproteinausbeuten. Eine Mglichkeit, die Laufzeit einer zellfreien Proteinsynthesereaktion zu verlngern, um somit hhere Proteinausbeuten zu erzielen, bietet die Verwendung von Dialysesystemen. In der Regel bestehen solche Systeme aus zwei Kammern, die ber eine Dialysemembran miteinander verbunden sind. ber die Membran gelangen die Aminosuren und energiereiche Substanzen (z.B. ATP, GTP) durch Diffusion in das Reaktionskompartiment, den eigentlichen Ort der Proteinsynthese. Gleichzeitig wird die Konzentration von inhibierenden Substanzen reduziert, da diese aus der Reaktionskammer heraus in die zweite Kammer diffundieren knnen. Anhand strukturell verschiedener Modellproteine, darunter mehrere ph (...truncated)