Électrochromatographie (CEC) ­ « Who is afraid of CEC ? »

Dossier Capillary electrophoresis ■ Électrochromatographie (CEC) “Who is afraid of CEC” A.M. Siouffi1, V. Tomao1 et J. Pesek2 1 UMR Synthèse, Catalyse et Chiralité, Faculté des Sciences et Techniques de Saint Jérome, Université d’Aix-Marseille III, 13397 Marseille Cedex 20, France 2 Department of Chemistry, San Jose State University, One Washington Square, San Jose, CA 95192, USA laquelle le tube contient une phase stationnaire. La phase mobile est en général une solution hydroorganique, la phase stationnaire est une silice greffée. C’est un hybride de la chromatographie et de l’électrophorèse. Les solutés sont séparés suivant leur mobilité électrophorétique et leur coefficient de distribution entre la phase mobile et la phase stationnaire. Comme toute technique hybride il y a des avantages et des inconvénients tirés de l’une et de l’autre méthode, et l’utilisateur éventuel peut se demander ce qui l’emporte. Nous donnerons tour à tour la parole à l’accusation et à la défense. Capillary electrochromatography (CEC) combines HPLC (High Performance Liquid Chromatography) and HPCE (High Performance Capillary Electrophoresis). The paper deals with some questions that arise to the beginner or those who are not experts in the technique. It is presented as a controversial debate between trained HPLC analyst and enthusiastic CEC user. It is summarized that the analyst can monitor many parameters such as fluid velocity, gradient formation, etc., to achieve excellent separations. Very small particles are capable of providing high efficiencies. Monoliths are under development. However CEC is not yet a mature technique since some problems must be solved such as frit manufacture, injection device and dedicated instrument. En CLHP, le contrôle de la vitesse linéaire du fluide vecteur peut être réalisé très aisément, ce n’est pas le cas de la CEC Il est vrai que les paramètres sont plus difficiles à maîtriser en CEC car la force ionique de la phase mobile et la température sont des facteurs qui n’interviennent que de façon minime en CLHP. La CEC est-elle aussi efficace (en nombre de plateaux) que la CLHP ? Figure 1. Reproduit avec la permission Technologies, Pleasanton, CA, USA. de Oui dans la mesure où l’on ne peut pas allonger indéfiniment une colonne de CLHP alors qu’on peut le faire avec une colonne de CEC puisqu’on n’est pas limité par la perte de charge. En CLHP, le liquide vecteur est véhiculé par une pompe et la pression disponible est le facteur limitant puisque la pression augmente avec la longueur de la colonne et surtout elle est inversement proportionnelle au carré du diamètre des particules. Avec 400 bars on ne peut guère envisager que des colonnes de 5 cm de long remplies avec des particules de 1,5 µm. En CEC, le déplacement du fluide vecteur est engendré par le flux électroosmotique. Si l’on considère simplement un tube de silice rempli de particules de silice, ces dernières forment une multitude de canaux capillaires interconnectés mais le potentiel ζ (zeta) est le même. Le flux osmotique est proportionnel à la quantité de charges accumulées à la surface du capillaire et des particules. Il est indépendant du diamètre de celles-ci, on peut remplir des capillaires avec des particules de 0,5 à 0,8 µm. Unimicro e façon simple, l’électrochromatographie capillaire (CEC) est une chromatographie liquide capillaire dans laquelle un champ électrique entraîne la phase mobile et les solutés. Une autre manière de voir les choses est de considérer qu’il s’agit d’une électrophorèse capillaire dans D ANALUSIS, 1999, 27, N° 2 151 © EDP Sciences, Wiley-VCH 1999 Article available at http://analusis.edpsciences.org or http://dx.doi.org/10.1051/analusis:1999270151 Dossier Capillary electrophoresis Le grand avantage de la CEC est le profil plat comparé au profil parabolique inhérent à l’hydrodynamique en CLHP. De toutes les contributions à l’élargissement des zones, seules la diffusion interparticulaire et la diffusion tourbillonnaire dépendent du profil de vitesse ; si les différences en termes de diffusion interparticulaire sont relativement faibles, la différence en terme de diffusion tourbillonnaire est importante. On a pu engendrer 100 000 plateaux en 2 minutes [1] et même plusieurs millions de plateaux par mètre [2]. Avec des capillaires remplis de petites particules (1,5 µm) les efficacités exprimées en hauteur de plateaux réduite ne sont grandes que pour des composés non retenus Figure 2. Séparations de progestérone [P] et de ses métabolites 17 α-hydroxyprogestérone [17P], 20 α-hydroxyprogestérone [20P], androsténédione [A] et testostérone [T] plus noréthindrone [N, référence interne standard] et thiourée, obtenues par (A) CEC, (B) CLHP, (C) CLHP avec changement de solvant. Conditions opératoires voir tableau I. On le constate expérimentalement et c’est surtout sensible lorsque les particules sont poreuses. Une différence notable est observée entre les particules poreuses et non poreuses. La préparation des frittés relève de l’habileté de l’analyste potassium. Les frittés sont testés en remplissant le capillaire d’eau et en montant en pression. La plupart des colonnes sont préparées par remplissage de capillaires de 20 – 100 µm de diamètre interne. Les particules de silice greffées ont un diamètre nominal de 0,5 à 1,5 µm. Les performances de telles colonnes dépendent de la qualité des frittés. La solution vient des colonnes monolithes comme celles réalisées par Horvath par sintorisation in situ [4]. C’est vrai. Il s’agit d’une étape cruciale qui conditionne la qualité de la séparation et la formation éventuelle de bulles. Plusieurs procédés ont été décrits [3]. En général, les frittés sont fabriqués par agglomération du support par chauffage au moyen d’un filament. Avec la silice hyper pure, on n’arrive pas à faire des frittés corrects car les polysilicates se forment à 550 °C en présence de sodium. Frechet et al. [5] ont préparé des monolithes par copolymérisation de méthacrylate de butyle, diméthacrylate d’éthylène et d’acide 2-acrylamido-2-méthyl-1 propane sulfonique. On fonde beaucoup d’espoirs sur les monolithes. Les frittés mécaniquement stables ne peuvent être réalisés qu’avec des silices contenant beaucoup de sodium. Il faut imprégner la silice par un silicate de sodium ou de Tableau I. Conditions opératoires de la figure 2. Dimensions des colonnes remplies Phase Stationnaire Phase Mobile Débit et vitesse lineaire CEC HPLC 20 cm (35 cm total) × 0.1 mm I. D. 20 cm × 4.6 mm I. D. 3 µm ODS Hypersil 3 µm ODS Hypersil CH3CN-CH3OH-20 mM Tris. HCl (pH 8) (37.5:37.5:25, v/v/v) CH3CN-CH3OH-20 mM Tris. HCl (pH 8) (37.5:37.5:25, v/v/v) (A) et (B) 30:20:50 (C) 5 cm/min (0.83 mm/s) à 15 kV 5 cm/min (0.83 mm/s) De Stead, D. A.; Reid, R. G.; Taylor, R. B. J. Chromatogr. 1998, 798, 259. (reproduit avec la permission d’Elsevier). 152 ANALUSIS, 1999, 27, N° 2 © EDP Sciences, Wiley-VCH 1999 Dossier Capillary electrophoresis blème [9]. Une partie (...truncated)