Superaufgelöste Mikroskopie: Pilze unter Beobachtung

380 W I S S EN S CH AFT · ME TH ODE N Mykologie Superaufgelöste Mikroskopie: Pilze unter Beobachtung SEBASTIAN SPUTH 1, SABINE PANZER 1, CHRISTIAN STIGLOHER 2 , ULRICH TERPITZ 1 1 LEHRSTUHL FÜR BIOTECHNOLOGIE UND BIOPHYSIK, BIOZENTRUM, UNIVERSITÄT WÜRZBURG 2 ZENTRALE ABTEILUNG FÜR MIKROSKOPIE, BIOZENTRUM, UNIVERSITÄT WÜRZBURG The diffraction limit of light confines fluorescence imaging of subcellular structures in fungi. Different super-resolution methods are available for the analysis of fungi that we briefly discuss. We exploit the filamentous fungus Fusarium fujikuroi expressing a YFP-labeled membrane protein showing the benefit of correlative light- and electron microscopy (CLEM), that combines structured illumination microscopy (SIM) and scanning election microscopy (SEM). DOI: 10.1007/s12268-021-1592-6 © Die Autoren 2021 ó Um zellbiologische Vorgänge in Pilzen zu untersuchen, kennzeichnen Mykologen A bestimmte subzelluläre Strukturen mit spezifischen Fluoreszenzfarbstoffen oder fluo- B C ˚ Abb. 1: Korrelative Licht- und Elektronenmikroskopie (LEM) an Dünnschnitten (65-100 nm dick) von Fusarium fujikuroi-CarO-YFP in LR-White. A, Übersicht über den experimentellen Ablauf für die korrelative Licht- und Elektronenmikroskopie. B, SIM-Aufnahmen. Die Zellwand wurde mit Calcofluor eingefärbt (türkis, links oben), YFP mit einem mit Alexa488-markierten Antikörper (pink, links unten). Überlagerung rechts. Maßstab: 5 μm. C, TEM-Aufnahme. Die Ultrastruktur der Hyphe ist deutlich zu erkennen. CW: Zellwand; ER: Endoplasmatisches Retikulum; M: Mitochondrium; N: Nucleus; V: Vakuole. Maßstab: 500 nm. reszierenden Proteinen wie dem gelb fluoreszierenden Protein (yellow fluorescent protein, YFP). Die fädigen Pilzzellen (Hyphen) sind meist sehr dünn und weisen Durchmesser zwischen zwei und drei Mikrometer auf. Bei der mikroskopischen Untersuchung der Hyphen stoßen Mykologen daher schnell auf ein Hindernis: das Abbe-Limit. Die mikroskopische Auflösung von Pilzen ist begrenzt Der Physiker und Optiker Ernst Abbe stellte im 19. Jahrhundert fest, dass aufgrund der Welleneigenschaften des Lichts keine noch so optimierte Optik fähig ist, Lichtstrahlen beliebig fein zu bündeln und dass die gebündelten Bereiche mindestens die Größe in etwa der halben Wellenlänge des eingesetzten Lichts haben. Anders ausgedrückt, können feine Details im mikroskopischen Untersuchungsobjekt nicht mehr getrennt dargestellt werden, wenn sie näher beieinanderliegen als ungefähr die halbe Wellenlänge des Lichts. Blaues Licht weist mit um die 400 Nanometer die kürzesten Wellenlängen innerhalb des sichtbaren Lichts auf. Damit liegt das Abbe-Limit je nach verwendeter Optik im Bereich von 150–200 Nanometern. Neue mikroskopische Verfahren erhöhen die Auflösung In den letzten Jahren wurden viele verschiedene Methoden entwickelt, die das AbbeLimit umgehen und die Auflösung der Fluoreszenzmikroskope deutlich verbessern. Diese Methoden werden unter dem Begriff „Superaufgelöste Fluoreszenzmikroskopie“ zusammengefasst. Besonders deutlich ist die Auflösungsverbesserung bei der Lokalisationsmikroskopie, die Techniken wie PALM (photoactivated localisation microscopy) und dSTORM (direct stochastic optical reconstruction microscopy) umfasst [1]. Die hierbei verwendeten Fluorophore geben normalerweise nach Anregung spontan innerhalb weniger Nanosekunden längerwelliges und energieärmeres Licht ab (Emission). Jedoch ist es mithilfe von sehr starken Lichtintensitäten und SauerstoffBIOspektrum | 04.21 | 27. Jahrgang 381 A B C ˚ Abb. 2: Korrelative Licht- und Elektronenmikroskopie von Fusarium fujikuroi-CarO-YFP. A, REM-Aufnahme mit korreliertem Fluoreszenzsignal der SIM-Aufnahmen mit Zellwand (türkis) und CarO-YFP (rot). Maßstab: 5 μm. B, Detailausschnitt. Von dieser Zelle wurde ein Z-Bildstapel erzeugt. Maßstab: 1 μm. C, Aus dem Bildstapel lässt sich nun ein Modell berechnen. Maßstab: 1 μm. mangel möglich, die Fluorophore im dunklen Zustand zu stabilisieren. Betrachtet man eine solche Probe, blinken einzelne Fluorophore nur kurz auf, um anschließend lange Zeit dunkel zu bleiben. Mit sensitiven Hochgeschwindigkeitskameras kann dieses Blinken als Bilderserie aufgenommen werden. In jedem Bild erscheinen Fluorophore als Punktspreizfunktion mit einem Maximum, dessen Lage durch eine einfache mathematische Analyse bestimmt werden kann. Werden alle diese Maxima in ein neues Bild übertragen, entsteht ein rekonstruiertes neues Bild, das unter optimalen Bedingungen auch Strukturen auflösen kann, die weniger als 20 Nanometer Abstand haben. Lokalisationsmikroskopie erfordert allerdings insbesondere bei Pilzen teils intensive Protokolloptimierungen. Seit wenigen Jahren gibt es für die Beobachtung von Strukturen jenseits des AbbeLimits einen neuen Ansatz, die Expansionsmikroskopie (ExM) [2]. Statt das Mikroskop zu modifizieren, vergrößert man bei dieser Technik die Probe selbst. Dies erreicht man, indem man Farbstoffe in einem Hydrogel verankert, das sich dann bei Entsalzung in Wasser ausdehnt. ExM wurde bereits erfolgreich an Pilzen wie Aspergillus fumigatus, Fusarium oxysporum und Ustilago maydis etabliert [3]. Für die regelmäßige Arbeit mit Pilzen hat sich in unserem Labor die Strukturierte Illuminationsmikroskopie (SIM) [4] bewährt. Bei BIOspektrum | 04.21 | 27. Jahrgang SIM befindet sich ein rotierendes Gitter im Strahlengang des Anregungslichts, das Beleuchtungsmuster in der Probe erzeugt. Das resultierende Fluoreszenzbild enthält auch Strukturinformationen jenseits der Auflösungsgrenze. Alle Bilder der verschiedenen Einstrahlwinkel werden miteinander verrechnet, und so wird ein neues superaufgelöstes Bild rekonstruiert. Die Aufnahmen können in verschiedenen Z-Ebenen erfolgen, um somit ein 3D-Bild zu erzeugen. SIM ist auch bei lebenden Zellen anwendbar. So lässt sich z. B. der pH-Gradient innerhalb von Pilzzellen darstellen, wie kürzlich am Maisbeulenbrand U. maydis gezeigt [5]. Gemeinsame Fluoreszenz- und Elektronenmikroskopie Klassischerweise wird und wurde die Elektronenmikroskopie (EM) verwendet, um mit einer Auflösung von unter einem Nanometer Strukturinfomationen weit jenseits des AbbeLimits zu erzielen. Allerdings erfordert die EM im Vergleich zur Lichtmikroskopie langwierige Fixierungs- und Einbettungsschritte der Probe. Die Ausgabe erfolgt in Graustufen, Farben werden nicht dargestellt. Daher ist es bestechend, die Vorteile von EM und Fluoreszenzmikroskopie zu verbinden. Man nennt diese Technik korrelative Licht- und Elektronenmikroskopie (CLEM), wobei Fluoreszenzsignale in elektronenmikroskopischen Bildern einer Struktur zugeordnet werden können. Erst die verbesserte Auflösung der modernen fluoreszenzmikroskopischen Verfahren sowie die wachsende Rechenkapazität von Computern ermöglichte eine systematische und sinnvolle Verknüpfung der Bildinformationen von Fluoreszenz- und Elektronenmikroskopie. Wir testeten, inwieweit dieser CLEMAnsatz an Pilzen praktiziert werden kann. Für diesen Versuch wählten wir den Schlauchpilz (Ascomycet) (...truncated)