Neueste technologische Entwicklungen für die Analyse von zirkulierender Tumor-DNA

Übersichten medgen DOI 10.1007/s11825-016-0089-z © Der/die Autor(en) 2016. Dieser Artikel ist eine Open-Access-Publikation. Peter Ulz · Jochen B. Geigl · Michael R. Speicher · Ellen Heitzer Institut für Humangenetik, Medizinische Universität Graz, Graz, Österreich Neueste technologische Entwicklungen für die Analyse von zirkulierender Tumor-DNA Hintergrund Das Potenzial der sog. Liquid Biopsy, womit u.a. die Analyse von zirkulierender Tumor-DNA (ctDNA) sowie zirkulierenden Tumorzellen (CTCs) bezeichnet wird, ist seit Längerem bekannt und in zahlreichen Übersichtsarbeiten umfassend diskutiert [1–5]. Arbeiten der letzten Jahre haben bewiesen, dass ctDNA die molekulargenetischen Veränderungen von Tumoren und deren Metastasen reflektiert und daher als Surrogatmarker für das gesamte Tumorgenom angesehen werden kann. Die Analyse von ctDNA erlaubt nicht nur eine kontinuierliche Überwachung des Therapieansprechens über den gesamten Krankheitsverlauf, sondern auch die Identifizierung von Resistenzmechanismen, neu aufkommenden Therapiezielen oder die Detektion einer minimalen Resterkrankung (MRD, engl. minimal residual disease). Viele Experten aus unterschiedlichen Disziplinen sind sich daher einig, dass die Analyse von ctDNA ein vielversprechendes Werkzeug für das Überwachen und Management von Krebspatienten darstellt (. Abb. 1). Dennoch findet die Analyse von ctDNA noch keine breite Anwendung in der klinischen Routine, hauptsächlich aufgrund von regulatorischen Hürden sowie des Fehlens von einheitlichen Verfahrensanweisungen (SOPs) für standardisierte Probengewinnung und nachfolgende Analysen oder die Befunderstellung. Diese Problematik wird an anderer Stelle in dieser Ausgabe diskutiert. Auch die Biologie der ctDNA hinsichtlich ihrer Freisetzung, Dynamik und Kinetik ist noch nicht vollständig geklärt. Unklar ist, inwieweit ctDNA tatsächlich ein repräsentatives Porträt der Krebserkrankung darstellt, oder ob ctDNA nur die am meisten proliferierenden Klone reflektiert. Außerdem unterscheidet sich die Prävalenz der ctDNA in verschiedenen Tumorentitäten und selbst innerhalb einer Entität findet man eine erhebliche Variabilität [6]. Die Tatsache, dass zellfreie DNA (cfDNA) auch bei gesunden Individuen zu finden ist, spricht dafür, dass es sich bei der Freisetzung eigentlich um einen physiologischen Prozess handelt. Studien weisen aber darauf hin, dass man in bestimmten pathologischen Konditionen wie dem systemischen Lupus erythematodes (SLE), der rheumatoiden Arthritis und speziell bei Tumorpatienten erhöhte Mengen an zellfreier DNA findet [3, 6–13]. cfDNA wird unter physiologischen Bedingungen durch im Blut vorhandene DNAsen rasch abgebaut. Die Tatsache, dass bei Tumorpatienten häufig eine erniedrigte DNAse-Aktivität festgestellt wurde, ist eine Erklärung für die erhöhten Konzentrationen an cfDNA [12]. Aufgrund der charakteristischen Größenverteilung der zirkulierenden DNA-Fragmente von rund 166 bp, die exakt der Länge der DNA, die um ein Nukleosom gewickelt ist inklusive der linker region entspricht, ist es naheliegend anzunehmen, dass die Mehrheit der Fragmente von apoptotischen Zellen stammt [14, 15]. Sobald ein Tumor zu wachsen beginnt, erhöht sich nicht nur die Tumormasse, es kommt auch gleichzeitig zu einem Anstieg des Zellsterbens. Dadurch kann es zu einer verstärkten Freisetzung der Tumor-DNA kommen, woraus ein Ungleichgewicht zwischen der Ausbreitung und dem Abbau von cfDNA resultiert [16]. Studien zeigten, dass die cfDNA von unterschiedlichen Zellen freigesetzt werden kann [17, 18], wobei in der Regel der Hauptteil der cfDNA auf Zellen aus dem hämatopoetischen System zurückgeführt werden kann. Bei Personen mit Krebserkrankungen kann jedoch die ctDNA in unterschiedlichen Prozentsätzen in der cfDNA präsent sein. Zusätzlich zum zellulären Turnover hängt die Menge der im Blut vorhandenen ctDNA von einer Reihe weiterer Faktoren ab, wie beispielsweise dem Tumorstadium, der Anzahl und Lokalisation der Tumorherde, der Vaskularität oder dem Therapieansprechen und wahrscheinlich noch anderen, zurzeit unbekannten Faktoren. All diese Faktoren können zu einer immensen Variabilität der ctDNA beitragen. Sogar im metastasierten Krebsstadium kann der Anteil der Tumor-DNA im Plasma weniger als 1 % bis zu mehr als 90 % ausmachen [3, 6]. Die Diskriminierung der Tumor-DNA von DNA-Fragmenten, die von gesunden Zellen stammen, ist somit zusammen mit der starken Fragmentierung eine große Herausforderung im Bereich der ctDNA-Analytik. In den letzten Jahren hat der technologische Fortschritt viele neue Methoden gebracht, die die nötige analytische Sensitivität und Spezifität aufweisen, um auch eine Detektion von stark unterrepräsentierten Allelen in der Zirkulation zu ermöglichen. Die meisten dieser sog. „High Resolution“ Methoden sind zielgerichtet, d. h. sie beschränken sich auf die Analyse von einzelnen oder wenigen bekannten Mutationen oder Hotspots (. Abb. 2). In späteren Stadien verändern sich die medizinische genetik Übersichten die Analyse von ctDNA sowie deren potenzielle Anwendungen diskutiert (. Tab. 1). Hochauflösende Methoden zu Detektion von unterrepräsentierten Allelen Abb. 1 8 Die Analyse zirkulierender Tumor-DNA (ctDNA) eröffnet vielerlei Möglichkeiten für den Einsatz in der Klinik. Für die Früherkennung von Tumoren bzw. Rezidiven sind hochauflösende Methoden notwendig, da die zu erwartende Menge an ctDNA gering ist. Das Monitoring der Tumorevolution, das Identifizieren von neuen Therapietargets sowie die Überwachung des Therapieerfolgs erfordern umfassendere Analysen und somit einen höheren Tumoranteil, da diese Methoden meist eine geringere analytische Sensitivität aufweisen. Bekannte Resistenzmechanismen können auch bei einem niedrigen Tumoranteil identifiziert werden, unbekannte hingegen erfordern genomweite Analysen, die bislang nur mit einem hohen Tumoranteil in der Probe möglich sind Tumorgenome zunehmend und kontinuierlich im Rahmen ihrer Progression und des selektiven Drucks von Therapien. Hier sind nicht zielgerichtete Ansätze, die das Genom umfassend analysieren, notwendig, um die Dynamik des Tumorgeschehens und neu auftretende Veränderungen im Tumorgenom kontinuierlich erfassen zu können (. Abb. 2). medizinische genetik Ein weiterer Vorteil solcher genomweiten Ansätze ist die Tatsache, dass sie sich nicht auf rekurrent auftretende Veränderungen beschränken und kein a priori Wissen über die genetische Zusammensetzung des Tumors notwendig ist [19–21]. Im Folgenden werden nun neue Technologien und methodische Ansätzen für In den letzten Jahren konnten in der Analyse von ctDNA, betreffend die analytische Sensitivität und Spezifität, erhebliche Fortschritte gemacht werden. Die erhöhte Sensitivität kann man einerseits auf den Einsatz von modifizierten Polymerasen mit einer reduzierten Fehlerrate sowie auf die Verwendung von digitalen Methoden und ausgefeilten bioinformatischen Algorithmen zurückführen. Seit den ersten zielgerichteten Mutationsanalysen in Plasma bzw. Serum in den (...truncated)