Ultrastruktur in 3D: neue Ansichten und Einsichten in der Zellbiologie

369 Elektronenmikroskopie Ultrastruktur in 3D: neue Ansichten und Einsichten in der Zellbiologie ELSA ARCALÍS, ULRIKE HÖRMANN-DIETRICH, EVA STÖGER INSTITUT FÜR PFLANZENBIOTECHNOLOGIE UND ZELLBIOLOGIE, UNIVERSITÄT FÜR BODENKULTUR, WIEN, ÖSTERREICH Three-dimensional electron microscopy (EM) has irrupted in the field of cell biology to provide exciting information at the structural level, including the shape and volume of organelles and their spatial distribution within the cell. Here, we present some examples of the application of 3D EM to the study of the plant endomembrane system, demonstrating the enormous potential of these techniques. DOI: 10.1007/s12268-023-1956-1 © Die Autorinnen 2023 ó In der Mikroskopie steht eine breite Palette von Techniken zur Verfügung, um Fragen der Pflanzenzellbiologie auf Einzelzellebene und mit hoher Auflösung zu untersuchen. Beispielsweise bietet die moderne Konfokalmikroskopie unter Verwendung verschiedener Fluoreszenzfarbstoffe und Fluoreszenzmarker eine hohe experimentelle Flexibilität bei der Beobachtung lebender Zellen. Die Möglichkeiten dieser optischen Methoden (unter dem Begriff Live Cell Imaging zusammengefasst), bieten eine räumliche und zeitliche Dimension, haben jedoch ein begrenztes Auflösungsvermögen und sind auch dadurch limitiert, dass nur Fluoreszenzsignale erkannt werden können, während unmarkierte Moleküle oder Organellen nicht sichtbar gemacht werden können [1]. Die überlegene Auflösung der Elektronenmikroskopie und die Möglichkeit, den gesamten Zellinhalt zu kontrastieren, z. B. durch Verwendung von Schwermetallen bei der Probenpräparation, erlauben es, die Ultrastruktur der gesamten Zelle auf einmal zu untersuchen [2], und machen damit die Elektronenmikroskopie zur perfekten Ergänzung des Live Cell Imagings. Dieser multimodale Ansatz setzt neue Maßstäbe in der Strukturforschung, da er skalenübergreifend ist. Auch wenn die elektronenmikroskopische Auflösung zellulärer Strukturen schwer zu überbieten ist, erlaubt konventionelle Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) nur BIOspektrum | 04.23 | 29. Jahrgang zweidimensionale Bilder eines räumlichen Objekts, was in manchen Fällen zu Fehlinterpretationen führen kann. Abbildung 1 zeigt beispielsweise einen Teil einer Pflanzenzelle einschließlich einer Vakuole, in deren Innenraum ein Mitochondrium zu sehen ist. Auf der Basis von Abbildung 1A kann dies jedoch nicht zweifelsfrei behauptet werden, denn das 2D-Bild könnte theoretisch auch dadurch zustande kommen, dass sich das Mitochondrium eigentlich außerhalb der Vakuole in einer Einstülpung des Tonoplasten befindet, die sich durch Verlust des vakuolären Innendrucks ausbilden kann. Wird dann der 2D-Schnitt zufällig quer durch diese Einstülpung geführt, kann der Eindruck entstehen, A B dass das Mitochondrium in der Vakuole liegt, obwohl das vielleicht gar nicht der Fall ist. Erst die 3D-Rekonstruktion (Abb. 1C) erlaubt zweifelsfrei die Schlussfolgerung, dass sich das Mitochondrium als Folge von Mitophagie innerhalb der Vakuole befindet. Das technische Prinzip von serial block face imaging Unter Berücksichtigung der Abmessungen der zu untersuchenden Objekte und der gewünschten räumlichen Auflösung wurden in den letzten Jahren mehrere elektronenmikroskopische Techniken zur Untersuchung von 3D-Volumina entwickelt. Eine davon ist die serielle Block-Face-Technik (SBF-SEM), die auf der Rasterelektronenmikroskopie (REM) basiert, um 2D-Bilder von der Oberfläche eingebetteter Gewebeschnitte zu erzeugen. Ein eingebautes Mikrotom schneidet dünne Schichten (∼30–40 nm) des Probenblocks und die neu entstandene Probenoberfl äche wird dann fotografiert. Nach einigen Schneide- und Aufnahmezyklen erhält man eine große Anzahl von Serienschnitten auf ultrastruktureller Ebene und damit einen Z-Stapel, der 3D-Informationen enthält. Diese Technik erlaubt die Untersuchung größerer Volumina und eignet sich daher besonders für die Darstellung der Mikroanatomie von Zellen und Geweben. C ˚ Abb. 1: 2D-Elektronenmikroskopie vs. 3D-Elektronenmikroskopie. A, einzelne Querschnittsebene einer Bilderserie in der Z-Achse, die ein Mitochondrium (Pfeil) in einer vakuolären Struktur zeigt (v). B, Tonoplast (gelb), Mitochondriums (rot). C, 3D-Rekonstruktion. Ein durch Mitophagie entstandener Einschluss des Mitochondriums ist klar erkennbar. Abgeändert von Arcalis et al. [9]. Maßstab 2 μm. 370 W I S S EN S CH AFT · S PECIA L : ZELLBI OLOGI E & CE LL IMAGING A B C D E F ˚ Abb. 2: 3D-Rekonstruktion von Endomembranorganellen in Zellen des Maissamens. A, REMER-Stränge (Pfeile), PBs (Pfeilspitzen) und Vakuolen (v). B, 3D-Rekonstruktion; massive ER-Membranzisternen (Pfeile). C, REM-ER-Stränge (Pfeile), PBs (Pfeilspitzen). D, 3D-Rekonstruktion; ER-Zisternen (Pfeil) und PBs, die in verschiedenen Ebenen von ER-Zisternen gebildet werden (gekennzeichnet als 1, 2 und 3). E, TEM-Vakuole (v) mit Globulineinschlüssen (*) und einem PB (Pfeilspitze). F, 3D-Rekonstruktion; völliger Einschluss von PBs zusammen mit Globulinen innerhalb der Vakuolen. Abgeändert von Arcalis et al. [4, 9]. Maßstab 2 μm (A, B), 1 μm (C). Welche neuen Schlussfolgerungen werden durch die hochauflösende 3D-Darstellung möglich? Besonders aufschlussreich und daher in diesem Artikel beispielhaft ausgeführt, ist die 3D-Elektronenmikroskopie von Zellorganellen, die dem Endomembransystem zugeordnet werden. Das endoplasmatische Retikulum (ER) zum Beispiel, ebenso wie auch diverse Vakuolen, können je nach Spezialisierung der Zelle und gemäß ihren spezifischen Funktionen unterschiedlich ausgeprägt sein. Ein extremes Beispiel hierfür sind die Zellen von Speichergeweben in Pflanzen- samen. In Samen von Gräsern übernehmen hauptsächlich die Zellen des Endosperms die Speicherfunktion, und entsprechend ist die Morphologie ihres Endomembransystems auf die Synthese und Akkumulierung von Proteinen spezialisiert. Abbildung 2A, B zeigt das extrem dichte Endomembransystem einer Endospermzelle in einem unreifen Maissamen. Die außergewöhnliche Entwicklung des ER, das ausschließlich aus massiven Zisternen besteht, und der Speichervakuolen, die in das Netzwerk des ER eingebettet sind, können nur in der dritten Dimension voll erfasst werden. Zusammenhänge zwischen ER und Speicherorganellen Das ER spielt eine entscheidende Rolle bei der Biosynthese von Proteinen und anderen Molekülen in den Zellen. Es ist das Organell mit der größten Membranfläche und besteht aus einem Netzwerk von Röhren und Zisternen, das je nach Zellspezialisierung und Entwicklungsstadium sehr variabel sein kann [3]. In Getreidesamen weist das ER eine hohe Plastizität auf, da es ein hohes Maß an Speicherproteinsynthese bewältigen muss und die entstehenden Proteine in neu gebildeten Speicherorganellen anordnet, welche protein bodies (PB) genannt werden. Im Mais führt dies zum Vorhandensein vieler kleiner PBs (0,6–1 μm). Außerdem sind die Zellen des Mais-Endosperms durch ER-Stränge charakterisiert. (Abb. 2A, C). Abbildung 2D zeigt die 3D-Rekonstruktion der ER (...truncated)