Chloroplasten: kleine Zellorganellen mit großem Potenzial

803 Chloroplastenbiotechnologie Chloroplasten: kleine Zellorganellen mit großem Potenzial JOSEPHIN LASKOWSKI, STEPHANIE RUF, RALPH BOCK, REIMO ZOSCHKE MAX-PLANCK-INSTITUT FÜR MOLEKULARE PFLANZENPHYSIOLOGIE, POTSDAM Chloroplast transformation is employed in basic research and green biotechnology. Using chloroplasts as bioreactors provides several advantages such as solar-powered high transgene expression, easy gene-targeting in the plastid genome by homologous recombination, increased biosafety due to tight transgene containment and the potential of engineering metabolic pathways in operon-like arrangements. These and other features make chloroplasts attractive for genetic engineering and biotechnology. DOI: 10.1007/s12268-023-2044-2 © Die Autorinnen und Autoren 2023 ó Pflanzen und andere photosynthetische Organismen bilden die Grundlage des Lebens auf der Erde. Mithilfe der Photosynthese produzieren sie Sauerstoff und Biomasse, die direkt oder indirekt von anderen Lebewesen konsumiert werden. In Pflanzen findet der Prozess der Photosynthese in speziellen zellulären Organellen, den Chloroplasten, statt. Chloroplasten verleihen Pflanzen ihre charakteristische Grünfärbung und sind Nachkommen von einst freilebenden, photosynthetischen Cyanobakterien. Diese Bakterien wurden vor rund einer Milliarde Jahren von einer eukaryotischen Zelle aufgenommen [1]. Man bezeichnet diesen Prozess als Endosymbiose. Chloroplasten haben daher genau wie der Zellkern ein eigenes Genom. Im Laufe der Zeit schrumpften jedoch die Größe des Genoms und die Anzahl der Gene beachtlich. Viele der ursprünglich bakteriellen Gene wurden in das Genom der eukaryotischen Wirtszelle integriert oder sind verloren gegangen, weil sie in der Symbiose überflüssig wurden [2]. Die meisten der verbliebenen Chloroplastengene, je nach Organismus ca. 100–250, sind direkt oder indirekt an der Photosynthese beteiligt. Chloroplasten haben ihre eigene Genexpressionsmaschinerie, die prokaryotischen Ursprungs ist. So sind z. B. Gene in Operon-ähnlichen Strukturen organisiert und werden durch eine prokaryotische RNA-Polymerase transkribiert. Die Proteinbiosynthese erfolgt durch prokaryotische 70S-Ribosomen. Diese Eigenschaften stamBIOspektrum | 07.23 | 29. Jahrgang men vom cyanobakteriellen Endosymbionten ab und haben sich bis heute erhalten. Allerdings gibt es auch zahlreiche Eigenheiten der chloroplastidären Genexpression, die weder bakteriellen noch eukaryotischen Ursprungs sind. Dazu gehören u. a. die Transkription einiger Gene durch eine bakteriophagenähnliche RNA-Polymerase, das Spleißen von Introns oder die nachträgliche Veränderung der genetischen Information durch RNAEditierung [3]. Trotz der geringen Größe des Chloroplastengenoms ist seine Genexpression erstaunlich leistungsfähig. So wird die große Untereinheit des CO 2-fixierenden Enzyms Rubisco, dem der Masse nach häufigstem Protein auf der Erde (das bis zu 50 % des Gesamtproteingehalts eines Blatts ausmachen kann), in Chloroplasten hergestellt. Diese eindrucksvolle Kapazität der Genexpression in Chloroplasten wird durch verschiedene Eigenschaften erreicht: Ein einziger Chloroplast enthält viele Genomkopien und gleichzeitig kann eine Pflanzenzelle zahlreiche Chloroplasten beherbergen, sodass die Transkription an tausenden Genkopien pro Zelle zeitgleich stattfindet. Des Weiteren sind die Prozesse der Transkription und der Translation sehr effizient [4, 5]. Hinzu kommt eine enorme Anreicherung von Transkripten und deren hohe Stabilität [6]. All dies trägt zu dem sehr hohen Potenzial der Proteinbiosynthese in Chloroplasten bei. Zusammengenommen machen diese Eigenschaften Chloroplasten zu einer äußerst attraktiven Mikrofabrik für die Biotechnologie. Methodik der genetischen Transformation von Chloroplasten Protokolle für die Transformation von Chloroplasten gibt es seit Ende der 1980er-Jahre. Zunächst wurde die Methodik in der einzelligen Grünalge Chlamydomonas reinhardtii etabliert und später für die Tabakpflanze Nicotiana tabacum angepasst [7, 8]. Inzwischen wurden Chloroplasten in zahlreichen anderen Spezies erfolgreich transformiert, darunter auch Nutzpflanzen wie Kartoffel oder Tomate [9]. Doch wie funktioniert eigentlich die Transformation des Chloroplastengenoms? Am häufigsten wird dafür die biolistische Methode verwendet (ein Kunstwort, das von „biologischer Ballistik“ abgeleitet wurde). Dabei werden kleinste Goldpartikel mit der FremdDNA überzogen und dann durch Hochgeschwindigkeitsbeschuss mit einer Partikelkanone in die Chloroplasten eingebracht (Abb. 1A). Die Fremd-DNA wird von Chloroplasten-DNA-Sequenzen flankiert, die durch homologe Rekombination die Integration in das Chloroplastengenom ermöglichen (Abb. 1B). Die Fremd-DNA beinhaltet üblicherweise auch einen Selektionsmarker, sodass Zellen mit erfolgreich transformiertem Chloroplastengenom auf einem selektiven Medium einen Wachstumsvorteil haben (Abb. 1A, B). Einer der am häufigsten verwendeten Selektionsmarker ist das aadAGen, das ursprünglich aus Escherichia coli isoliert wurde. Dieses Gen codiert das Enzym Aminoglykosid-3″-adenylyltransferase, welches die Antibiotika Spectinomycin und Streptomycin inaktiviert [9]. Nach der Transformation gibt es einige Herausforderungen, u. a. die Regeneration von homoplastomischen Pflanzen, das heißt Pflanzen die nur noch transformierte Chloroplastengenome enthalten und keine Wildtyp-Chloroplastengenome. Durch den Partikelbeschuss werden anfänglich lediglich einzelne Chloroplastengenome in wenigen Zellen transformiert (Abb. 1A). Diese Zellen sind heteroplastomisch, das heißt, sie enthalten eine Mischung 804 B I O T ECH NOLOGIE A B C [11]. Allerdings konnten mehrere neutrale Insertionsregionen im Chloroplastengenom identifiziert werden, bei denen solche Effekte minimiert sind und die Transgeninsertion und -expression keinen Einfluss auf das Pflanzenwachstum hat [12]. Anwendungen der Chloroplastentransformation D ˚ Abb. 1: Chloroplastentransformation und ihre Anwendungen in Grundlagenforschung und Biotechnologie. A, Blätter werden mit einer Partikelkanone beschossen, wodurch einzelne Transformationsereignisse induziert werden (Chloroplasten sind als hellgrün ausgefüllte Ovale dargestellt – der Übersichtlichkeit halber sind andere Zellkompartimente, wie Kern oder Mitochondrien, nicht gezeigt; rote und grüne Kreise innerhalb der Chloroplasten zeigen transformierte Chloroplastengenome und Wildtyp-Chloroplastengenome). Durch kontinuierliche Gewebekultur auf Selektionsmedium wird die Vermehrung der transplastomischen Zellen begünstigt, während Wildtyp-Zellen sich nicht teilen und vermehren können. Am Ende bringt die selektive Gewebekultur eine homoplastomische Pflanze hervor, die ausschließlich transformierte Chloroplastengenome, aber keine Wildtyp-Chloroplastengenome enthält. B, Die Integration der Transgene in das Chloroplastengenom wird durch homologe Rekombination ermöglicht, welche eine gezielte Insertion in eine gewünschte Position im Chloroplastengenom erlaubt (blaue (...truncated)