Ko-translationale Assemblierung von Proteinkomplexen

723 Methoden der Proteinforschung Ko-translationale Assemblierung von Proteinkomplexen KAI FENZL, GÜNTER KRAMER, BERND BUKAU ZENTRUM FÜR MOLEKULARE BIOLOGIE DER UNIVERSITÄT HEIDELBERG (ZMBH) UND DEUTSCHES KREBSFORSCHUNGSZENTRUM (DKFZ), DKFZ-ZMBH ALLIANZ, HEIDELBERG The majority of cellular proteins exerts their biological activity as oligomeric complexes. The general view was that complexes form by random collision of folded subunits in the cytosol. Recent studies question this view by demonstrating that a surprisingly high number of complexes are formed during translation. Co-translational assembly occurs by interaction either of fully synthesized subunits with nascent partner subunits, or of two nascent polypeptides exposed by proximal ribosomes. DOI: 10.1007/s12268-021-1682-5 © Die Autoren 2021 ó Schon während der Translation beginnt die Faltung neu synthetisierter Proteine in native dreidimensionale Tertiärstrukturen, wobei einzelne Proteindomänen, oft durch Chaperone assistiert, sukzessive falten. Die Mehrheit der gefalteten Proteine muss jedoch noch zu Quartärstrukturen assemblieren, die aus homomeren oder heteromeren Untereinheiten bestehen. Es wurde generell angenommen, dass sich die beteiligten Untereinheiten über freie Diffusion und zufällige Kollisionen innerhalb der Zelle finden. Während einerseits die Diffusionsgeschwindigkeit von Proteinen in der Zelle hoch genug erscheint, um Proteinkomplexe innerhalb von Sekunden ausbilden zu lassen, exponieren freie Untereinheiten oft hydrophobe Interaktionsflächen, was die Anfälligkeit für Aggregation, proteolytischen Abbau und unspezifische Interaktionen mit anderen Zellproteinen erhöht. Ein Verlust an Effizienz der Proteinassemblierung ist somit höchst problematisch, gerade für wachsende menschliche Zellen, die hunderttausende Proteine pro Minute herstellen. Aktuelle Ergebnisse zeigen, dass die Assemblierung von stabilen Proteinkomplexen in der Regel ko-translational, also während der Synthese der Untereinheiten durch das Ribosom, stattfindet und damit die freie Diffusion aggregationsanfälliger Untereinheiten minimiert. Die ersten BIOspektrum | 07.21 | 27. Jahrgang Hinweise auf ko-translationale Assemblierung von Proteinkomplexen stammen bereits aus den 1960er-Jahren, die belegen, dass das Tetramer der bakteriellen β-Galactosidase seine enzymatische Aktivität erlangt, bevor die Synthese abgeschlossen ist [1]. In den letzten fünf Jahren wurde dieser Prozess mehrfach für Proteine in Bakterien, Bäckerhefe und humane Zellen nachgewiesen [2–7]. Dabei zeigte sich, dass zwei mechanistische Varianten der ko-translationalen Assemblierung von Proteinkomplexen existieren. Mechanismus 1: Co-Post-Assemblierung Bei der Co-Post-Assemblierung genannten Variante assoziiert ein vollständig synthetisiertes, gefaltetes Protein mit einer naszierenden Partneruntereinheit und bildet am translatierenden Ribosom einen dimeren Komplex aus (Abb. 1A). Der Durchbruch zum experimentellen Nachweis dieses Prozesses war die Entwicklung einer Hochdurchsatzmethode, dem selective ribosome profiling (SeRP) [8–10]. SeRP ermöglicht es, Interaktionen eines ausgewählten Proteins, z. B. der Untereinheit eines Proteinkomplexes oder eines Chaperons, mit translatierenden Ribosomen genomweit zu detektieren [8–10]. Dabei werden zunächst alle Ribosomen einer Zelle isoliert, die sich als Polysomen auf translatierten mRNAs aufreihen, gefolgt von einem Nukleaseverdau der mRNA. Dabei schützt jedes Ribosom ein kurzes mRNA Segment vor dem Verdau (ribosome footprint). Anschließend wird die zu untersuchende Untereinheit eines Proteinkomplexes zusammen mit der assoziierten naszierenden Partneruntereinheit und dem translatierenden Ribosom affinititätsgereinigt. Durch das Sequenzieren der ribosome footprints kann ausgelesen werden, mit welcher naszierenden Polypeptidkette die affinitätsgereinigte Proteinuntereinheit ko-translational interagiert. Dadurch kann bestimmt werden, wann die Assemblierung während der Translation beginnt, und somit auch die Länge der naszierenden Polypeptidkette, bei der die Assemblierung anfängt (Abb. 1B). Die ko-translationale Komplexbildung konnte für mehrere heteromere Proteinkomplexe nachgewiesen werden, z. B. für die Fettsäuresynthase der Bäckerhefe [4] und für Transkriptionsfaktoren in menschlichen Zellen [7]. Von zwölf untersuchten Proteinkomplexen der Hefe folgten neun einem ko-translationalen Assemblierungsprozess, und für die drei Fälle, in denen dies nicht beobachtet wurde, war bekannt, dass die Assemblierung durch spezielle Faktoren posttranslational reguliert wird [4]. Die ko-translationale Assemblierung zeigte meist einen gerichteten Verlauf, d. h. ein vollständig synthetisiertes „Protein A“ interagiert mit der naszierenden Kette des „Partnerproteins B“, aber nicht umgekehrt (Abb. 1C). Diese gerichtete Assemblierung korreliert mit dem Grad der Aggregations- und Degradationsanfälligkeit der naszierenden Polypeptidketten. In allen untersuchten Fällen unterdrückt die Bindung der Partneruntereinheiten die Aggregation und Degradation der ko-translational assemblierenden Proteinuntereinheiten. Die Partneruntereinheiten, die als vollständig gefaltete Proteine binden, neigen dagegen nicht zur Aggregation oder Degradation [4]. Daher liegt es nahe anzunehmen, dass dieser Assemblierungsmodus instabile Untereinheiten während der Synthese stabilisiert und damit die Evolution komplex gefalteter Pro- 724 W I S S EN S CH AFT · S PECIA L : PROTE INANALYTI K A B C ˚ Abb. 1: Detektion von Co-Post-Assemblierung. A, Co-Post-Assemblierung kann zwischen zwei Ribosomen auf derselben mRNA (cis-Assemblierung, häufig in Prokaryoten) oder auf zwei unterschiedlichen mRNAs (trans-Assemblierung, häufig in Eukaryoten) auftreten. B, SeRP-Methode: Ribosomen werden nach Zelllyse und Ribonukleaseverdau (1) direkt oder nach einer Affinitätsaufreinigung eines Zielproteins (z. B. einer Untereinheit) isoliert (2). Die ribosome footprints beider Fraktionen werden sequenziert und der translatierten Sequenz eines Genes zugeordnet (3). Ein Anstieg spezifischer ribosome footprints in der aufgereinigten Fraktion einer codierenden Sequenz weist auf eine Co-Post-Assemblierung hin. C, SeRP-Analyse des Fettsäuresynthasekomplexes aus Hefe [4]: Die Assemblierung beruht auf der gerichteten Interaktion einer vollständig synthetisierten β-Untereinheit mit einer naszierenden α-Untereinheit. Abbildung in Anlehnung an [4]. teine ermöglicht. Im Einklang mit dieser protektiven Funktion ist der Befund, dass in allen untersuchten Fällen die Bindung der Partneruntereinheit sofort nach dem Austreten der Interaktionsdomäne aus dem ExitTunnel des Ribosoms während der Translation stattfindet. Ko-translational agierende Enzyme und Chaperone müssen daher räumlich und funktional darauf abgestimmt und vermutlich zum Zeitpunkt der Partnerbindung bereits von der naszierenden Peptidkette dissoziiert sein. Dies konnte für das ribosomenassoziierte Hsp70 Chaperon der Hefe, Ssb, nachgewiesen werden [4,11]. (...truncated)