β-adrenerge Rezeptoren besitzen ein Aktivierungsgedächtnis

0 Korrespondenzadresse: Dr. Andrea Ahles Institut fr Pharmakologie und Toxikologie Technische Universitt Mnchen Biedersteiner Strae 29 D-80802 Mnchen Tel.: 089-41403277 Adrenerge Rezeptoren vermitteln die zellulren Antworten auf die Stimulation durch die Stresshormone Adrenalin und Noradrenalin und stellen gleichzeitig wichtige Zielstrukturen fr hufig verwendete Arzneimittel dar. Ihre Funktion und ihr Ansprechen auf Liganden werden durch Polymorphismen in ihrer Primrsequenz moduliert. Die zugrunde liegenden Mechanismen sind jedoch weitgehend unklar [1]. Wir haben die Technik des FluoreszenzResonanz-Energietransfers (FRET) genutzt, - Fritz-Klz-Preis 2011 der DGPT ANDREA AHLES INSTITUT FR PHARMAKOLOGIE UND TOXIKOLOGIE, TU MNCHEN um den Einfluss der am hufigsten vorkom menden Polymorphismen im 2-adrenergen Rezeptor (2AR) auf die Konformation des Rezeptors nach Aktivierung zu untersuchen. Dafr wurden FRET-Sensoren fr die 2ARVarianten mit einem gelb fluoreszierenden Protein (YFP) sowie einem cyan fluoreszierenden Protein (CFP) in der dritten intrazellulren Schleife bzw. am C-Terminus hergestellt (Abb. 1A, B). Nach Stimulierung der 2AR-Sensoren konnte die Aktivierung der polymorphen Rezeptorvarianten in lebenden Zellen in Echtzeit untersucht werden. Dabei behielten die FRET-Sensoren sowohl die Bindungsaffinitten der nativen Rezeptoren als Abb. 1: A, Schematischer Aufbau der 2AR-FRET-Sensoren. B, subzellulre Lokalisation der 2AR-FRET-Sensor-Varianten in HEK-293-Zellen. Konfokalmikroskopische Aufnahmen reprsentativer Einzelzellen. C, oben: schematische Darstellung des experimentellen Ansatzes zur Untersuchung der Aktivierungskinetik bei wiederholter Stimulation der 2AR-Sensoren. Mitte: Mittelwert und Standardfehler aus n = 5 monoexponentiell gemittelten Kurven der ersten und zweiten Aktivierung. Unten: Zeitkonstanten fr die erste und darauf folgende zweite Aktivierung (n = 7) (aus [2], AAAAS). auch eine intakte Funktionalitt hinsichtlich der Bildung des sekundren Botenstoffes cAMP. Die Analyse der Aktivierungskinetik ergab sehr hnliche Geschwindigkeiten der verschiedenen polymorphen 2AR-Varianten nach einmaliger Stimulation. Die Kinetik nderte sich jedoch nach Vorstimulation in Abhngigkeit des Vorliegens bestimmter Rezeptorvarianten (Abb. 1C). So konnten wir im Vergleich zur ersten Aktivierung eine schnellere Aktivierung der effizienteren Gly16-Variante des 2AR feststellen, whrend die weniger effiziente Arg16-Variante dagegen bei einer wiederholten Stimulation langsamer aktiviert wurde. Diese Ergebnisse lassen auf ein polymorphismusspezifisches Rezeptorgedchtnis schlieen. Die Ausbildung der unterschiedlichen Aktivierungskinetik hing von der Interaktion des Rezeptors mit lslichen intrazellulren Faktoren ab und bedurfte einer Phosphorylierung intrazellulrer Serin- und Threoninreste durch G-Protein-gekoppelte Rezeptorkinasen [2]. Die Daten implizieren eine polymorphismusabhngige Eigenschaft des 2AR, die die Aktivierungskinetik der Rezeptoren bei wiederholter Stimulation determiniert. Diese knnte auch fr die zwischen Individuen variierende Ansprechbarkeit auf -Agonisten und -Blocker mitverantwortlich sein. (...truncated)